本文關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦mTOR信號通路中重要基因的克隆和功能的初步研究

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【摘要】：本研究通過對凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)進行轉(zhuǎn)錄組測序,并結(jié)合模式生物中mTOR信號通路的已有研究結(jié)果,分析獲得了33個可能參與凡納濱對蝦mTOR信號通路調(diào)控作用的基因片段。在此基礎(chǔ)上,從凡納濱對蝦肌肉組織中克隆得到raptor、eif4e2和eif4e1a三個基因的cDNA序列。raptor基因cDNA序列全長5020 bp,開放閱讀框3804 bp,編碼1267個氨基酸殘基;eif4e2基因cDNA序列全長1069 bp,開放閱讀框699 bp,編碼232個氨基酸殘基;eif4e1a基因cDNA序列全長3579 bp,開放閱讀框627 bp,編碼208個氨基酸殘基。氨基酸推斷序列比對和進化分析均證實,凡納濱對蝦Raptor蛋白與其他已知Raptor蛋白為同源蛋白,eIF4E2和eIF4E1A為目前已知的eIF4E家族蛋白的同源蛋白。利用Realtime-PCR實時熒光定量的方法研究了tor、raptor、eif4ebp、eif4e2和eif4e1a五個基因在凡納濱對蝦不同組織中的表達差異,結(jié)果表明:(1)凡納濱對蝦tor、raptor、eif4ebp、eif4e2和eif4e1a五個基因在眼柄、肝胰臟、腸道、胃、鰓絲和肌肉等組織中均有表達。(2)tor基因在肝胰臟、肌肉和眼柄中的表達量顯著高于其在腸道、胃和鰓絲中的表達量(p0.05);在肝胰臟中表達量顯著高于眼柄中的表達量,肝胰臟和肌肉中表達量之間沒有顯著差異,眼柄和肌肉中的表達量之間也沒有顯著差異;在腸道、胃和鰓絲中,tor基因表達量之間沒有顯著差異。(3)raptor基因在肝胰臟中表達量顯著高于其他組織(p0.05),腸道、胃和肌肉中的表達量之間沒有顯著差異,但腸道中表達量顯著高于眼柄和鰓絲(p0.05),同時眼柄、胃、鰓絲和肌肉中的表達量之間沒有顯著差異。(4)eif4ebp基因在肌肉中的表達量極顯著高于其他組織(p0.01),鰓絲中表達量次之,在眼柄、肝胰臟、腸道和胃中的表達量之間沒有顯著差異且表達量都相對較少。(5)eif4e2基因在肌肉中的表達量顯著高于其他組織,eif4e1a基因在腸道和肌肉中都有較高表達量,且在腸道中的表達量顯著高于其在肌肉中的表達量(p0.05)。利用Realtime-PCR實時熒光定量的方法研究了注射雷帕霉素或氨基酸后肌肉中tor、raptor、eif4ebp、eif4e2和eif4e1a五個基因表達量的變化情況,探討了tor、raptor、eif4ebp、eif4e2和eif4e1a五個基因在mTOR信號通路中的信號傳遞調(diào)控機制及其在細胞生長中的調(diào)控作用。研究結(jié)果表明:(1)注射雷帕霉素后2個小時內(nèi)肌肉中tor、raptor、eif4e2和eif4e1a基因表達量都出現(xiàn)顯著下降,eif4ebp基因表達量顯著上升(p0.05),說明凡納濱對蝦mTOR信號通路對雷帕霉素敏感。(2)肌肉中tor和raptor基因的表達量在單獨注射亮氨酸4個小時內(nèi)均未出現(xiàn)變化;在注射精氨酸或者同時注射亮氨酸和精氨酸后,肌肉中tor和raptor基因的表達量均在半小時出現(xiàn)顯著上升(p0.05)。(3)肌肉中eif4e1a基因的表達量在單獨注射亮氨酸或精氨酸4個小時內(nèi)均未出現(xiàn)變化,但在同時注射亮氨酸和精氨酸后表達量均顯著增加(p0.05);肌肉中eif4e2基因在注射亮氨酸或精氨酸,以及同時注射亮氨酸和精氨酸后表達量都明顯提高(p0.05),且同時注射亮氨酸和精氨酸后,基因表達變量明顯比單獨注射亮氨酸或精氨酸后變化量大。以上研究結(jié)果表明,氨基酸能夠激活凡納濱對蝦mTOR信號通路中基因的轉(zhuǎn)錄表達,且與小鼠、斑馬魚等模式生物相似,凡納濱對蝦eif4e2和eif4e1a基因能夠通過mTOR信號通路接收不同氨基酸信號來調(diào)控細胞生長。綜上所述,凡納濱對蝦mTOR信號通路對雷帕霉素敏感,且可以接收氨基酸信號調(diào)控細胞生長。本研究首次克隆了凡納濱對蝦中參與mTOR信號通路的幾個關(guān)鍵基因的全長cDNA序列,并對其功能進行了初步研究。不僅為mTOR信號通路的系統(tǒng)發(fā)生研究提供了參考,而且從分子水平了解對蝦的生長和代謝調(diào)控機制,對于對蝦飼料配方的優(yōu)化也具有重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：凡納濱對蝦 mTOR 雷帕霉素 氨基酸
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;S917.4
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 緒論10-22
• 1.1 水產(chǎn)動物分子營養(yǎng)學(xué)的研究10-12
• 1.2 營養(yǎng)素調(diào)控和基因表達12
• 1.3 mTOR信號通路12-20
• 1.3.1 TOR蛋白12-13
• 1.3.2 mTOR信號通路參與調(diào)控的生命過程及調(diào)控機制13-16
• 1.3.3 水產(chǎn)動物mTOR信號通路的研究進展16-20
• 1.4 本研究的目的和意義20-22
• 第二章 實驗材料與方法22-28
• 2.1 實驗材料22-24
• 2.1.1 凡納濱對蝦22
• 2.1.2 基因克隆和實時熒光定量引物設(shè)計與合成22
• 2.1.3 儀器設(shè)備22-24
• 2.2 實驗方法24-28
• 2.2.1 凡納濱對蝦總RNA的提取24
• 2.2.2 cDNA第一鏈的合成24-26
• 2.2.4 基因表達的組織分布26
• 2.2.5 雷帕霉素注射實驗26-27
• 2.2.6 氨基酸注射實驗27-28
• 第三章 實驗結(jié)果28-48
• 3.1 凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組測序分析28-29
• 3.2 基因全長cDNA的克隆29-40
• 3.2.1 肌肉總RNA的提取29-30
• 3.2.2 基因cDNA全長序列克隆30-37
• 3.2.3 蛋白質(zhì)氨基酸序列的對比分析37-40
• 3.3 基因表達的組織分布40-42
• 3.3.1 SYBR Green實時熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化40
• 3.3.2 基因的組織表達分析40-42
• 3.4 基因應(yīng)答雷帕霉素注射的表達分析42-45
• 3.5 基因應(yīng)答氨基酸注射的表達分析45-48
• 第四章 研究討論48-54
• 4.1 基因cDNA序列、氨基酸序列及結(jié)構(gòu)特征分析48-49
• 4.1.1 raptor基因的cDNA序列和氨基酸序列的分析48
• 4.1.2 兩個eif4e家族基因的cDNA序列和氨基酸序列的分析48-49
• 4.2 基因組織表達特征49-50
• 4.3 基因功能研究分析50-54
• 4.3.1 tor、raptor和eif4ebp基因的功能研究分析50-51
• 4.3.2 兩個eIF4E家族基因的功能研究分析51-53
• 4.3.3 tor、raptor、eif4ebp、eif4e2和eif4e1a之間的相互作用探討53-54
• 第五章總結(jié)與展望54-56
• 5.1 研究總結(jié)54-55
• 5.2 研究展望55-56
• 參考文獻56-66
• 致謝66-67
• 作者簡歷67-68
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果68

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1 衣萌萌;于赫男;林小濤;許忠能;周小壯;;密度脅迫下凡納濱對蝦的行為與生理變化[J];暨南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版);2012年01期

2 周歧存,丁q，

本文編號：775417