本文關(guān)鍵詞：利用數(shù)字基因表達(dá)譜測序分析雞HSP25基因?qū)?xì)胞凋亡的作用

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【摘要】：在哺乳動(dòng)物小分子熱應(yīng)激蛋白(Small heat shock proteins,s HSPs)家族中,熱應(yīng)激蛋白25/27kD(HSP25/27)基因的高表達(dá)能夠主導(dǎo)聚集體沉積,防止錯(cuò)誤折疊蛋白之間不可逆結(jié)合,從而緩解因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受協(xié)迫而造成的細(xì)胞凋亡。但卵生動(dòng)物胚胎各組織中HSP25的序列和結(jié)構(gòu)都異于哺乳動(dòng)物。在熱應(yīng)激條件下,雞HSP25基因(cHSP25)高表達(dá)是否也起著保護(hù)細(xì)胞的作用仍不明確。cHSP25在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中涉及的信號通路未有報(bào)導(dǎo),探究這些通路中的物質(zhì)變化對闡明卵生動(dòng)物特有的HSP25基因在細(xì)胞凋亡過程中的作用具有重要研究意義。本研究在37℃培養(yǎng)箱對雞成纖維細(xì)胞系(DF-1)分別進(jìn)行干擾和過表達(dá)cHSP25基因,通過數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)分析參與細(xì)胞凋亡的相關(guān)通路及相應(yīng)基因的表達(dá)情況,利用熱應(yīng)激(45℃,3h)處理DF-1,qRT-PCR檢測相關(guān)基因和流氏細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。結(jié)果表明:(1)干擾組cHSP25基因mRNA相對表達(dá)量下降50%;過表達(dá)組cHSP25基因mRNA相對表達(dá)量升高500倍。(2)DGE測序分析結(jié)果揭示,與對照組相比,干擾組只有1個(gè)未注釋的下調(diào)差異表達(dá)基因;過表達(dá)組共有95個(gè)差異表達(dá)基因,其中60個(gè)為表達(dá)量上調(diào)基因,35個(gè)為下調(diào)基因。與干擾組相比,過表達(dá)組共有32個(gè)差異表達(dá)基因,其中有19個(gè)為表達(dá)量上調(diào)基因,13個(gè)為下調(diào)基因。雞DF-1過表達(dá)cHSP25后,KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),PPARG和LAMA2富集于癌癥通路等;BDNF富集于嗜中性粒細(xì)胞信號通路和經(jīng)典MAP激酶信號通路。(3)在熱應(yīng)激處理雞DF-1后,過表達(dá)組的HSP27和HSP70基因的表達(dá)顯著下降,差異表達(dá)基因BDNF、LAMA2和PPARG及其相關(guān)通路的下游基因AKT和NFk B的表達(dá)量顯著下調(diào),流氏細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),S期細(xì)胞數(shù)增加,總凋亡細(xì)胞數(shù)增加。綜上所述,在熱應(yīng)激條件下,雞DF-1細(xì)胞系cHSP25基因持續(xù)高表達(dá)促使細(xì)胞周期停滯和加劇細(xì)胞凋亡,其通過下調(diào)HSP27和HSP70基因表達(dá),并且抑制BDNF、LAMA2和PPARG及其下游通路基因AKT和NFk B在中性粒細(xì)胞信號通路和MAPK信號通路等的作用實(shí)現(xiàn)。
【關(guān)鍵詞】：數(shù)字基因表達(dá)譜 雞成纖維細(xì)胞系 HSP25基因 過表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S831
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-11
• 1 前言11-13
• 2 材料與方法13-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)13-14
• 2.2 主要儀器設(shè)備14-15
• 2.3 主要試劑及配制15-17
• 2.3.1 主要試劑15-16
• 2.3.2 主要試劑配制16-17
• 2.3.2.1 克隆和細(xì)胞凍存所需試劑配制16
• 2.3.2.2 SDS-PAGE膠電泳所需試劑的配制16-17
• 2.3.2.3 Western Blot所需試劑的配制17
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法17-30
• 2.4.0 細(xì)胞培養(yǎng)方法17-18
• 2.4.0.1 雞胚成纖維細(xì)胞DF-1 的復(fù)蘇17-18
• 2.4.0.2 雞胚成纖維細(xì)胞DF-1 的傳代培養(yǎng)18
• 2.4.0.3 雞胚成纖維細(xì)胞DF-1 的凍存18
• 2.4.1 不同溫度刺激DF-1 細(xì)胞18-19
• 2.4.2 DF-1 的總RNA抽提方法19
• 2.4.3 DF-1 總RNA反轉(zhuǎn)錄19
• 2.4.4 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)19-21
• 2.4.5 qRT-PCR檢測方法的組分和程序21
• 2.4.6 Western Bolt檢測方法21-22
• 2.4.6.1 細(xì)胞蛋白樣品制備21
• 2.4.6.2 總蛋白的保存21
• 2.4.6.3 Western Blot檢測cHSP25蛋白的表達(dá)21-22
• 2.4.7 細(xì)胞凋亡檢測22-23
• 2.4.8 細(xì)胞周期檢測23-24
• 2.4.9 siRNA干擾雞DF-1 中的HSP25基因24-25
• 2.4.9.1 HSP25干擾片段合成24
• 2.4.9.2 siRNA-cHSP25轉(zhuǎn)染DF-124-25
• 2.4.9.3 cHSP25 siRNA干擾效果檢測25
• 2.4.9.4 熱應(yīng)激下干擾cHSP25對相關(guān)基因及細(xì)胞的檢測25
• 2.4.10 在雞DF-1 中過表達(dá)cHSP2525-30
• 2.4.10.1 cHSP25基因分子克隆25-27
• 2.4.10.2 cHSP25過表達(dá)載體構(gòu)建27-29
• 2.4.10.3 pcDNA3.1-cHSP25過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DF-129
• 2.4.10.4 pcDNA3.1-cHSP25過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效果檢測29
• 2.4.10.5 熱應(yīng)激下過表達(dá)cHSP25對相關(guān)基因及細(xì)胞的檢測29-30
• 2.5 數(shù)據(jù)分析30-31
• 3 結(jié)果31-68
• 3.1 干擾cHSP25基因?qū)﹄uDF-1 細(xì)胞系的影響31-35
• 3.1.1 cHSP25干擾片段轉(zhuǎn)染效果31-33
• 3.1.1.1 轉(zhuǎn)染干擾片段的DF-1 細(xì)胞形態(tài)31
• 3.1.1.2 細(xì)胞總RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄31-32
• 3.1.1.3 cHSP25的干擾效果32-33
• 3.1.2 干擾cHSP25對其它HSPs的影響33-34
• 3.1.3 干擾cHSP25對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響34-35
• 3.2 過表達(dá)cHSP25基因?qū)﹄uDF-1 細(xì)胞系的影響35-40
• 3.2.1 pcDNA3.1-cHSP25過表達(dá)載體驗(yàn)證35-36
• 3.2.2 pcDNA3.1-cHSP25過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效果36-38
• 3.2.2.1 轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體的DF-1 細(xì)胞形態(tài)36
• 3.2.2.2 細(xì)胞系總RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄36-37
• 3.2.2.3 cHSP25過表達(dá)效果37-38
• 3.2.3 過表達(dá)cHSP25對其它HSPs的影響38
• 3.2.4 過表達(dá)cHSP25對細(xì)胞凋亡和周期的影響38-40
• 3.3 數(shù)字基因表達(dá)譜測序40-52
• 3.3.1 數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計(jì)40-42
• 3.3.2 比對分析42-43
• 3.3.3 表達(dá)量分析43-44
• 3.3.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)44-46
• 3.3.5 GO功能分析46
• 3.3.6 KEGG通路分析46-50
• 3.3.7 差異表達(dá)基因和下游通路基因檢測50-52
• 3.3.7.1 干擾HSP25基因?qū)Σ町惐磉_(dá)基因及下游通路基因的檢測50-51
• 3.3.7.2 過表達(dá)HSP25基因?qū)Σ町惐磉_(dá)基因及下游通路基因的檢測51-52
• 3.4 熱應(yīng)激對DF-1 細(xì)胞系及期相關(guān)基因的影響52-58
• 3.4.1 不同溫度條件下的細(xì)胞形態(tài)52-53
• 3.4.2 不同溫度條件下的細(xì)胞總RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄53
• 3.4.3 熱應(yīng)激對cHSP25表達(dá)量的影響53-55
• 3.4.4 熱應(yīng)激對其它HSPs的表達(dá)量影響55
• 3.4.5 熱應(yīng)激對差異表達(dá)基因和下游通路基因表達(dá)量的影響55-56
• 3.4.6 熱應(yīng)激對細(xì)胞凋亡和周期的影響56-58
• 3.5 熱應(yīng)激條件下干擾cHSP25基因?qū)ο嚓P(guān)基因和細(xì)胞的影響58-63
• 3.5.1 熱應(yīng)激條件下cHSP25干擾片段轉(zhuǎn)染效果58-59
• 3.5.1.1 熱應(yīng)激條件下轉(zhuǎn)染干擾片段的DF-1 細(xì)胞形態(tài)58
• 3.5.1.2 細(xì)胞總RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄58-59
• 3.5.1.3 熱應(yīng)激條件下cHSP25的干擾效果59
• 3.5.2 熱應(yīng)激條件下干擾cHSP25對其它HSPs的影響59-60
• 3.5.3 熱應(yīng)激條件下干擾cHSP25對差異表達(dá)基因和下游通路基因的影響60-61
• 3.5.4 熱應(yīng)激條件下干擾cHSP25對細(xì)胞凋亡和周期的影響61-63
• 3.6 熱應(yīng)激條件下過表達(dá)cHSP25基因?qū)ο嚓P(guān)基因和細(xì)胞的影響63-68
• 3.6.1 熱應(yīng)激條件下pcDNA3.1-cHSP25過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效果63-64
• 3.6.1.1 熱應(yīng)激條件下轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體的DF-1 細(xì)胞形態(tài)63
• 3.6.1.2 細(xì)胞系總RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄63-64
• 3.6.1.3 熱應(yīng)激條件下cHSP25過表達(dá)效果64
• 3.6.2 熱應(yīng)激條件下過表達(dá)cHSP25對其它HSPs的影響64-65
• 3.6.3 熱應(yīng)激條件下過表達(dá)cHSP25對差異表達(dá)基因和下游通路基因的影響65-66
• 3.6.4 熱應(yīng)激條件下過表達(dá)cHSP25對細(xì)胞凋亡和周期的影響66-68
• 4 討論68-74
• 4.1 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期變化的關(guān)系68-69
• 4.2 熱應(yīng)激誘導(dǎo)HSPs表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡69-70
• 4.3 DGE測序分析的差異表達(dá)基因70-73
• 4.4 下游通路相關(guān)基因的分析73-74
• 5 結(jié)論74-75
• 致謝75-76
• 參考文獻(xiàn)76-82
• 附錄82-88

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：766231