本文關(guān)鍵詞：耐鹽植物鹽芥吸鉀排鈉的生理機制及基因調(diào)控網(wǎng)絡研究

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【摘要】：土壤鹽漬化(soil salinization/salination)或者鹽脅迫(salt stress)是使農(nóng)業(yè)作物的產(chǎn)量降低或者作物不能生長的現(xiàn)象,土壤鹽漬化影響植物的生理生化指標,如抑制種子萌發(fā)率、破壞離子平衡(如Na+/K+平衡)、細胞功能、抑制植株高度、干重、產(chǎn)量、改變糖和氨基酸等代謝物質(zhì)含量、抗氧化物酶活性等,影響著農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì),因此鹽漬化正嚴重限制著我國乃至世界的農(nóng)作物產(chǎn)量提升及農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展。Na+/K+失衡是土壤鹽漬化最明顯的表現(xiàn)之一,土壤鹽漬化導致的Na+/K+失衡破壞植物體內(nèi)原有的離子平衡,因而破壞Na+、K+各自所參與的代謝,如維護細胞膜電位、調(diào)控酶活性等。本研究通過對擬南芥哥倫比亞型(Arabidopsis thaliana, Columbia, Col)、高水楊酸生態(tài)型(Cape Verde Islands, Cvi-0)、抗鹽脅迫能力較強的鹽芥(Thellungiella salsuginea,鹽芥)和低水楊酸的NahG轉(zhuǎn)基因植物為實驗材料,采用鹽脅迫(100mM NaCl)、水楊酸(SA,0.5 mM) 和 SA的抑制劑多效唑(PBZ,0.5 mM)預處理、結(jié)合消減雜交以及轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)手段探究鹽芥吸鉀排鈉—耐鹽脅迫的生理機制,以及水楊酸在其中起到的關(guān)鍵作用。本文得到的主要結(jié)果如下：(1)缺乏水楊酸的植物耐鹽脅迫,但并非通過吸鉀排鈉的生理機制利用哥倫比亞型Col、高水楊酸生態(tài)型Cvi-0 和 NahG轉(zhuǎn)基因材料為實驗材料,分別用100mM Na+ 和 100mM K+脅迫處理擬南芥,并檢測鹽脅迫對葉面積(第3片真葉)、葉片數(shù)、植株含水量、植株鮮重、Na+、 K+含量的影響,結(jié)果顯示100mM Na+和100 mM K+脅迫后,三個品種中葉面積、葉片數(shù)、植株含水量、鮮重都有不同程度的下降,并且100 mM Na+處理顯著增加植株Na+含量(p0.01),降低K+含量(p0.05),而100 mMK+脅迫后,植株體內(nèi)K+含量升高(p0.01),Na+含量降低(p0.05)。比較哥倫比亞型Col、生態(tài)型Cvi-0和NahG轉(zhuǎn)基因材料中以上指標的變化程度,顯示NahG中的生理生化指標受鹽脅迫的影響程度最小,表明NahG轉(zhuǎn)基因材料的抗鹽脅迫能力較強。但NahG轉(zhuǎn)基因植物耐鹽并非通過吸鉀排鈉的生理機制,其K+含量與Col并無顯著差異,推測其耐鹽機制可能與其抗氧化能力較強有關(guān)。(2)水楊酸通過促進吸鉀排鈉提高植物的耐鹽性以擬南芥和鹽芥為實驗材料,分別用05 mM SA 和 0.5 mM PBZ預處理后,再用100 mM NaCl脅迫處理,檢測植株含水量、Na+、K+含量,活性氧檢測(H202染色法)、可溶性糖濃度、丙二醛(MDA)含量、電導率的變化。結(jié)果顯示SA處理使鹽脅迫導致的植株含水量下降幅度減緩(p0.05)。鹽脅迫還造成可溶性糖濃度下降(p0.05)、MDA含量上升(p0.05)、電導率上升(p0.01)、活性氧含量升高。而這些參數(shù)在SA處理下變化幅度減小,表明SA處理后植株的抗鹽脅迫能力增強。而PBZ預處理可部分逆轉(zhuǎn)SA的作用。SA處理能夠顯著緩解鹽脅迫下的Na+含量上升(p0.05),同時促進K+吸收(p0.05),而PBZ抑制SA的作用,所以SA緩解鹽脅迫的機制與其“吸鉀排鈉”作用有關(guān)。鹽芥本身對鹽脅迫有很強的抗性,在鹽脅迫下K+含量顯著高于擬南芥(p0.05),而Na+含量顯著低于擬南芥(p0.05)。SA可以進一步促進鹽芥吸鉀排鈉的能力,而PBZ抑制這種能力。(3)鹽脅迫擬南芥轉(zhuǎn)錄組測序及消減雜交分析通過對鹽脅迫前后擬南芥和鹽芥的轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學分析,利用消減雜交(SSH)技術(shù)篩到鹽芥中的特異性高表達的基因。對差異表達基因的GO(Gene Ontology)和KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway富集分析表明它們主要與激素應答、氧化酶活性、脅迫反應等相關(guān),并且擬南芥和鹽芥差異表達的基因所屬代謝通路不盡相同,如擬南芥中的差異基因富集在P53、自噬、FOXO等通路上,而鹽芥中與鹽脅迫相關(guān)基因顯著富集在NF-kB、HIF-1、MAPK、戊糖磷酸等途徑上。當然擬南芥和鹽芥差異表達的基因也富集在一些共通的代謝通路上,如氨基酸代謝、糖代謝、以及植物激素信號轉(zhuǎn)導等。另外我們還篩選到一批鹽芥特有的差異表達的基因,如C2H2和WRKY轉(zhuǎn)錄因子和脫落酸(ABA)信號相關(guān)基因。SA通路代表性基因NPR1口PR1在鹽脅迫后擬南芥中的表達量降低(Fold change,FC1),而在鹽脅迫后鹽芥中的表達量卻升高(FC3),說明鹽芥具有較高的抗鹽能力可能與其SA相關(guān)基因表達增強或者SA信號激活有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：鹽脅迫 水楊酸 Na~+/K~+平衡 抑制性消減雜交技術(shù) 轉(zhuǎn)錄組測序
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q945
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 緒論12-15
• 1.1 土壤鹽漬化的現(xiàn)狀12
• 1.2 土壤鹽脅迫對植物的危害12-15
• 1.2.1 Na~+/K~+失衡對種子萌發(fā)率的影響12-13
• 1.2.2 對植物器官和生長發(fā)育的危害13-14
• 1.2.3 對植物生理生化指標的影響14-15
• 1.2.4 Na~+/K~+失衡對作物育性的影響15
• 2 文獻綜述15-22
• 2.1 植物抗鹽堿能力的獲得機制15-18
• 2.1.1 通過植物適應性馴化15-16
• 2.1.2 植物育種方法16-17
• 2.1.3 利用外源物質(zhì)17-18
• 2.2 外源SA緩解植物抗Na~+/K~+失衡機制18-22
• 2.2.1 促進“吸鉀排鈉”18-19
• 2.2.2 SA相關(guān)基因表達調(diào)控19-21
• 2.2.3 SA調(diào)控其他激素21-22
• 3 材料與方法22-34
• 3.1 實驗材料22
• 3.2 實驗設計22-23
• 3.2.1 鹽脅迫實驗設計22
• 3.2.2 SA和PBZ抗脅迫預處理實驗設計22-23
• 3.2.3 鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組測序?qū)嶒炘O計23
• 3.3 生理生化指標檢測方法23-25
• 3.3.1 葉片數(shù)目及葉面積檢測23
• 3.3.2 植株鮮重和含水量23-24
• 3.3.3 Na~+、K~+含量測定24
• 3.3.4 活性氧檢測24
• 3.3.5 MDA含量檢測24
• 3.3.6 可溶性糖濃度檢測24-25
• 3.3.7 離子滲透率測量25
• 3.4 轉(zhuǎn)錄組測序25
• 3.4.1 total RNA提取25
• 3.4.2 RNA濃度和純度檢測25
• 3.4.3 mRNA富集、片段化、建庫、上機測序25
• 3.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的生物信息學分析25-27
• 3.5.1 測序數(shù)據(jù)的標準分析25-26
• 3.5.2 差異表達基因分析26
• 3.5.3 差異基因表達模式聚類分析26
• 3.5.4 差異基因的GO分類、富集分析26-27
• 3.5.5 差異表達基因的KEGG pathway富集分析27
• 3.6 抑制性差減雜交技術(shù)(SSH)篩選耐鹽脅迫相關(guān)基因27-33
• 3.6.1 RNA提取27
• 3.6.2 cDNA合成27-28
• 3.6.3 RsaⅠ酶切及純化28-29
• 3.6.4 鏈接接頭29-30
• 3.6.5 SSH30-31
• 3.6.6 巢式PCR31-33
• 3.7 差異基因分析33-34
• 3.7.1 文庫陽性克隆的鑒定33-34
• 3.7.2 差異基因分析34
• 4 實驗結(jié)果與分析34-66
• 4.1 鹽脅迫對擬南芥生理指標的影響34-41
• 4.1.1 鹽脅迫對葉面積和葉片數(shù)的影響34-35
• 4.1.2 鹽脅迫對植株高度的影響35-36
• 4.1.3 鹽脅迫對植株鮮重和含水量的影響36-38
• 4.1.4 鹽脅迫對Na~+、K~+含量的影響38-39
• 4.1.5 討論39-41
• 4.2 SA和PBZ預處理對緩解擬南芥鹽脅迫效果評價41-48
• 4.2.1 SA和PBZ預處理對含水量和離子滲透率的影響41-42
• 4.2.2 SA和PBZ預處理對K~+和Na~+含量的影響42-44
• 4.2.3 SA和PBZ預處理對活性氧含量的影響44-45
• 4.2.4 SA和PBZ預處理對MDA和可溶性糖含量的影響45-46
• 4.2.5 討論46-48
• 4.3 轉(zhuǎn)錄組測序及SSH技術(shù)篩選抗鹽脅迫基因48-66
• 4.3.1 鹽脅迫相關(guān)差異表達基因篩選48-50
• 4.3.2 差異基因表達模式聚類分析50
• 4.3.3 差異基因的GO富集分析50-54
• 4.3.4 差異基因的KEGG pathway富集分析54-56
• 4.3.5 KEGG pathway的可視化56-57
• 4.3.6 SSH篩選鹽脅迫差異基因57-63
• 4.3.6.1 鹽脅迫差異基因篩選57-58
• 4.3.6.2 鹽芥特異性同源差異基因篩選58-60
• 4.3.6.3 鹽芥特異性鹽脅迫基因篩選60-63
• 4.3.6.4 NPR1和PR1基因表達差異鑒定63
• 4.3.7 討論63-66
• 5 結(jié)論66-68
• 參考文獻68-76
• 致謝76-77
• 論文發(fā)表情況77

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