本文關(guān)鍵詞：南極適冷菌Psychrobacter sp.G溫度適應(yīng)相關(guān)假定蛋白基因的表達(dá)分析

  更多相關(guān)文章： 適冷菌 轉(zhuǎn)錄組 假定蛋白 qRT-PCR western blotting

【摘要】：南極具有長(zhǎng)年低溫、干燥、低營(yíng)養(yǎng)、強(qiáng)輻射及溫度變化大等特點(diǎn),蘊(yùn)藏了極為豐富和特殊的微生物資源。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明,南極適冷菌Psychrobacter sp.G經(jīng)冷激(0℃)和熱激(30℃)脅迫后,分別有11和46、12和48個(gè)基因的表達(dá)量顯著上調(diào)和下調(diào),其中包括許多功能未知基因。本文對(duì)其中3個(gè)表達(dá)量顯著變化的功能未知基因進(jìn)行了基因克隆與序列分析,并利用qRT-PCR和western blotting技術(shù)分別從m RNA水平和蛋白水平進(jìn)一步研究了其在不同溫度/鹽度脅迫條件下的表達(dá)情況,以期揭示該菌株適應(yīng)南極特殊環(huán)境的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析表明,菌株G的假定蛋白基因PSYCG_03870(AGP48309.1)經(jīng)熱激(30℃)后表達(dá)量可顯著上升(log2FC=2.5,FDR≤0.05);基因序列分析表明,該基因ORF為177 bp,基因上下游的調(diào)控序列包括-10、-35、TIS和RBS等調(diào)控區(qū),以及3′端終止密碼子的下游有一個(gè)多聚腺苷酸信號(hào)序列AATAAA;氨基酸序列的疏水性分析表明,該基因編碼的蛋白C端帶有較強(qiáng)的疏水區(qū)域(score0),無(wú)跨膜區(qū)存在。BLASTP分析表明,與之相似性最高的功能蛋白為未命名蛋白產(chǎn)物(unnamed protein product,CCW68256.1)(37%)。在mRNA水平上,該基因的表達(dá)顯著被低溫抑制,高溫誘導(dǎo);鹽度脅迫時(shí),該基因顯著被低鹽抑制,高鹽誘導(dǎo);溫/鹽協(xié)同脅迫下,該基因可顯著被低溫低鹽(0℃,15)和低溫高鹽(0℃,90)誘導(dǎo),高溫低鹽(30℃,15)和高溫高鹽(30℃,90)抑制。在蛋白水平上,低溫和高溫脅迫下其蛋白表達(dá)量均可增加;鹽度脅迫時(shí),該蛋白表達(dá)亦可被低鹽抑制,高鹽誘導(dǎo);溫/鹽協(xié)同脅迫下,6 h時(shí),在高溫低鹽(30℃,15)條件下蛋白表達(dá)量變化不大,并且除在2 h、6 h時(shí)被高溫高鹽(30℃,90)誘導(dǎo)以外,其余條件下均被抑制。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析表明,菌株G的假定蛋白基因PSYCG_10180(AGP49518.1)經(jīng)冷激(0℃)后表達(dá)量可顯著上升(log2FC=4.1,FDR≤0.05);基因序列分析表明,該基因ORF為624 bp,基因上下游的調(diào)控序列包括-10、-35、TIS和RBS等調(diào)控區(qū),以及位于起始密碼子ATG下游10 bp處長(zhǎng)14 bp的下游框;氨基酸序列的疏水性分析表明,該基因編碼的蛋白C端帶有較強(qiáng)的疏水區(qū)域(score0),其中181-203 AA為典型的跨膜區(qū)域,表明該蛋白可能為跨膜蛋白。BLASTP分析表明,與之相似性最高的已知功能蛋白為藍(lán)光傳感蛋白(blue light sensor protein,WP_010201745.1)(37%)。在mRNA水平上,該基因的表達(dá)顯著被低溫誘導(dǎo),高溫抑制;鹽度脅迫時(shí),所有鹽度均顯著抑制其表達(dá);溫/鹽協(xié)同脅迫下,該基因顯著被低溫低鹽(0℃,15)誘導(dǎo),高溫高鹽(30℃,90)抑制。在蛋白水平上,溫度脅迫時(shí),其蛋白表達(dá)于6 h內(nèi)均被抑制,較長(zhǎng)時(shí)間(12h)內(nèi)均被誘導(dǎo);鹽度脅迫時(shí),蛋白表達(dá)均可被低鹽和高鹽抑制;溫/鹽協(xié)同脅迫下,蛋白表達(dá)除在2 h時(shí)被高溫低鹽(30℃,15)誘導(dǎo)以外,其余條件下均被抑制。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析表明,菌株G的假定蛋白基因PSYCG_06740(AGP48869.1)經(jīng)冷激(0℃)后表達(dá)量可顯著下降(log2FC=-6.4,FDR≤0.05);基因序列分析表明,該基因ORF為1236 bp,基因上下游的調(diào)控序列包括-10、-35、TIS和RBS等調(diào)控區(qū),位于位于-35區(qū)上游1 bp處的AT-rich UP element以及位于起始密碼子ATG下游10 bp處長(zhǎng)14 bp的下游框;氨基酸序列疏水性分析表明,蛋白沒(méi)有明顯的疏水區(qū)域,也不存在跨膜區(qū)域。BLASTP分析表明,與之相似性最高的已知功能蛋白為ATP相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白(ATP-grasp domain-containing protein,WP_011513612.1)(97%)。在mRNA水平上,該基因的表達(dá)顯著被低溫抑制,高溫誘導(dǎo);鹽度脅迫時(shí),低鹽和高鹽脅迫下基因表達(dá)均被顯著抑制;溫/鹽協(xié)同脅迫下,該基因的表達(dá)在低溫低鹽(0℃,15)時(shí)可極顯著被誘導(dǎo),高溫高鹽(30℃,90)時(shí)極顯著被抑制。在蛋白水平上,其蛋白表達(dá)亦可被低溫抑制,高溫誘導(dǎo);鹽度脅迫時(shí),蛋白表達(dá)均可被低鹽和高鹽誘導(dǎo)或抑制;溫/鹽協(xié)同脅迫下,蛋白表達(dá)在短時(shí)間(2 h)內(nèi)均可被誘導(dǎo),較長(zhǎng)時(shí)間(12h)內(nèi)均被抑制。本研究為揭示南極適冷菌Psychrobacter sp.G對(duì)極地極端環(huán)境的分子適應(yīng)機(jī)制,闡明假定功能基因在南極適冷菌生境適應(yīng)性中的作用提供了基礎(chǔ)資料和科學(xué)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：適冷菌 轉(zhuǎn)錄組 假定蛋白 qRT-PCR western blotting
【學(xué)位授予單位】：國(guó)家海洋局第一海洋研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;Q93
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 前言13-27
• 1.1 極地微生物研究概況13-14
• 1.2 極地生物對(duì)溫度適應(yīng)性的研究進(jìn)展14-19
• 1.2.1 冷激/熱激蛋白14-17
• 1.2.2 冷適應(yīng)蛋白17-19
• 1.2.3 假定蛋白19
• 1.3 基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)與假定蛋白基因的發(fā)現(xiàn)19-22
• 1.3.1 基因組學(xué)19-20
• 1.3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)與假定蛋白基因的發(fā)現(xiàn)20-22
• 1.4 假定蛋白的功能探究22-25
• 1.5 目的意義及主要研究?jī)?nèi)容25-27
• 第二章 假定蛋白基因PSYCG_03870的克隆與序列分析及對(duì)溫度/鹽度脅迫的響應(yīng)27-47
• 2.1 材料與方法28-33
• 2.1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑28-29
• 2.1.2 基因組DNA的提取29
• 2.1.3 引物設(shè)計(jì)與基因全長(zhǎng)的獲取29
• 2.1.4 基因序列分析29-30
• 2.1.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建30
• 2.1.5.1 表達(dá)載體pET22b和目的基因的連接和轉(zhuǎn)化30
• 2.1.5.2 重組子的鑒定30
• 2.1.6 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與多克隆抗體的制備30
• 2.1.7 脅迫處理30-31
• 2.1.8 參比基因/蛋白的確定31-32
• 2.1.9 qRT-PCR32
• 2.1.10 Western blotting32-33
• 2.2 結(jié)果與分析33-44
• 2.2.1 假定蛋白基因PSYCG_03870的序列分析33-36
• 2.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建36-37
• 2.2.3 假定蛋白PSYCG_03870在重組菌中的表達(dá)和純化37-38
• 2.2.4 菌株G在不同溫度/鹽度脅迫下的生長(zhǎng)曲線38-40
• 2.2.5 在mRNA水平上對(duì)溫度/鹽度脅迫的應(yīng)答特征40-42
• 2.2.6 在蛋白水平上對(duì)溫度/鹽度脅迫的應(yīng)答特征42-44
• 2.3 討論44-45
• 2.4 小結(jié)45-47
• 第三章 假定蛋白基因PSYCG_10180的克隆與序列分析及對(duì)溫度/鹽度脅迫的響應(yīng)47-63
• 3.1 材料與方法47-49
• 3.1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑47
• 3.1.2 基因組DNA的提取47
• 3.1.3 引物設(shè)計(jì)與基因全長(zhǎng)的獲取47-48
• 3.1.4 基因序列分析48
• 3.1.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建48
• 3.1.5.1 表達(dá)載體pET22b和目的基因的連接和轉(zhuǎn)化48
• 3.1.5.2 重組子的鑒定48
• 3.1.6 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與多克隆抗體的制備48-49
• 3.1.7 脅迫處理49
• 3.1.8 參比基因/蛋白的確定49
• 3.1.9 qRT-PCR49
• 3.1.10 Western blotting49
• 3.1.11 重組菌株pET22b+ PSYCG_10180的抗凍活性測(cè)定49
• 3.2 結(jié)果與分析49-60
• 3.2.1 假定蛋白基因PSYCG_10180的序列分析49-53
• 3.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建53-54
• 3.2.3 假定蛋白PSYCG_10180在重組菌中的表達(dá)和純化54-55
• 3.2.4 在mRNA水平上對(duì)溫度/鹽度脅迫的應(yīng)答特征55-57
• 3.2.5 在蛋白水平上對(duì)溫度/鹽度脅迫的應(yīng)答特征57-59
• 3.2.6 重組菌株的抗凍融活性59-60
• 3.3 討論60-61
• 3.4 小結(jié)61-63
• 第四章 假定蛋白基因PSYCG_06740的克隆與序列分析及對(duì)溫度/鹽度脅迫的響應(yīng)63-78
• 4.1 材料與方法63-65
• 4.1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑63
• 4.1.2 基因組DNA的提取63
• 4.1.3 引物設(shè)計(jì)與基因全長(zhǎng)的獲取63-64
• 4.1.4 基因序列分析64
• 4.1.5 原核表達(dá)載體的構(gòu)建64
• 4.1.6 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)、純化與多克隆抗體的制備64-65
• 4.1.7 脅迫處理65
• 4.1.8 參比基因/蛋白的確定65
• 4.1.9 qRT-PCR65
• 4.1.10 Western blotting65
• 4.2 結(jié)果與分析65-75
• 4.2.1 假定蛋白基因PSYCG_06740的序列分析65-69
• 4.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建69-70
• 4.2.3 假定蛋白PSYCG_06740在重組菌中的表達(dá)和純化70-71
• 4.2.4 在mRNA水平上對(duì)溫度/鹽度脅迫的應(yīng)答特征71-73
• 4.2.5 在蛋白水平上對(duì)溫度/鹽度脅迫的應(yīng)答特征73-75
• 4.3 討論75-77
• 4.4 小結(jié)77-78
• 第五章 總結(jié)與展望78-81
• 5.1 總結(jié)78-79
• 5.2 展望79-81
• 參考文獻(xiàn)81-91
• 附錄91-93
• 碩士期間發(fā)表文章93-95
• 致謝95

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本文編號(hào)：751114