本文關鍵詞：南極適冷菌Psychrobacter sp.G溫度適應相關假定蛋白基因的表達分析

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【摘要】：南極具有長年低溫、干燥、低營養(yǎng)、強輻射及溫度變化大等特點,蘊藏了極為豐富和特殊的微生物資源。轉錄組學研究表明,南極適冷菌Psychrobacter sp.G經(jīng)冷激(0℃)和熱激(30℃)脅迫后,分別有11和46、12和48個基因的表達量顯著上調(diào)和下調(diào),其中包括許多功能未知基因。本文對其中3個表達量顯著變化的功能未知基因進行了基因克隆與序列分析,并利用qRT-PCR和western blotting技術分別從m RNA水平和蛋白水平進一步研究了其在不同溫度/鹽度脅迫條件下的表達情況,以期揭示該菌株適應南極特殊環(huán)境的分子機制。轉錄組測序比較分析表明,菌株G的假定蛋白基因PSYCG_03870(AGP48309.1)經(jīng)熱激(30℃)后表達量可顯著上升(log2FC=2.5,FDR≤0.05);基因序列分析表明,該基因ORF為177 bp,基因上下游的調(diào)控序列包括-10、-35、TIS和RBS等調(diào)控區(qū),以及3′端終止密碼子的下游有一個多聚腺苷酸信號序列AATAAA;氨基酸序列的疏水性分析表明,該基因編碼的蛋白C端帶有較強的疏水區(qū)域(score0),無跨膜區(qū)存在。BLASTP分析表明,與之相似性最高的功能蛋白為未命名蛋白產(chǎn)物(unnamed protein product,CCW68256.1)(37%)。在mRNA水平上,該基因的表達顯著被低溫抑制,高溫誘導;鹽度脅迫時,該基因顯著被低鹽抑制,高鹽誘導;溫/鹽協(xié)同脅迫下,該基因可顯著被低溫低鹽(0℃,15)和低溫高鹽(0℃,90)誘導,高溫低鹽(30℃,15)和高溫高鹽(30℃,90)抑制。在蛋白水平上,低溫和高溫脅迫下其蛋白表達量均可增加;鹽度脅迫時,該蛋白表達亦可被低鹽抑制,高鹽誘導;溫/鹽協(xié)同脅迫下,6 h時,在高溫低鹽(30℃,15)條件下蛋白表達量變化不大,并且除在2 h、6 h時被高溫高鹽(30℃,90)誘導以外,其余條件下均被抑制。轉錄組測序比較分析表明,菌株G的假定蛋白基因PSYCG_10180(AGP49518.1)經(jīng)冷激(0℃)后表達量可顯著上升(log2FC=4.1,FDR≤0.05);基因序列分析表明,該基因ORF為624 bp,基因上下游的調(diào)控序列包括-10、-35、TIS和RBS等調(diào)控區(qū),以及位于起始密碼子ATG下游10 bp處長14 bp的下游框;氨基酸序列的疏水性分析表明,該基因編碼的蛋白C端帶有較強的疏水區(qū)域(score0),其中181-203 AA為典型的跨膜區(qū)域,表明該蛋白可能為跨膜蛋白。BLASTP分析表明,與之相似性最高的已知功能蛋白為藍光傳感蛋白(blue light sensor protein,WP_010201745.1)(37%)。在mRNA水平上,該基因的表達顯著被低溫誘導,高溫抑制;鹽度脅迫時,所有鹽度均顯著抑制其表達;溫/鹽協(xié)同脅迫下,該基因顯著被低溫低鹽(0℃,15)誘導,高溫高鹽(30℃,90)抑制。在蛋白水平上,溫度脅迫時,其蛋白表達于6 h內(nèi)均被抑制,較長時間(12h)內(nèi)均被誘導;鹽度脅迫時,蛋白表達均可被低鹽和高鹽抑制;溫/鹽協(xié)同脅迫下,蛋白表達除在2 h時被高溫低鹽(30℃,15)誘導以外,其余條件下均被抑制。轉錄組測序比較分析表明,菌株G的假定蛋白基因PSYCG_06740(AGP48869.1)經(jīng)冷激(0℃)后表達量可顯著下降(log2FC=-6.4,FDR≤0.05);基因序列分析表明,該基因ORF為1236 bp,基因上下游的調(diào)控序列包括-10、-35、TIS和RBS等調(diào)控區(qū),位于位于-35區(qū)上游1 bp處的AT-rich UP element以及位于起始密碼子ATG下游10 bp處長14 bp的下游框;氨基酸序列疏水性分析表明,蛋白沒有明顯的疏水區(qū)域,也不存在跨膜區(qū)域。BLASTP分析表明,與之相似性最高的已知功能蛋白為ATP相關結構域蛋白(ATP-grasp domain-containing protein,WP_011513612.1)(97%)。在mRNA水平上,該基因的表達顯著被低溫抑制,高溫誘導;鹽度脅迫時,低鹽和高鹽脅迫下基因表達均被顯著抑制;溫/鹽協(xié)同脅迫下,該基因的表達在低溫低鹽(0℃,15)時可極顯著被誘導,高溫高鹽(30℃,90)時極顯著被抑制。在蛋白水平上,其蛋白表達亦可被低溫抑制,高溫誘導;鹽度脅迫時,蛋白表達均可被低鹽和高鹽誘導或抑制;溫/鹽協(xié)同脅迫下,蛋白表達在短時間(2 h)內(nèi)均可被誘導,較長時間(12h)內(nèi)均被抑制。本研究為揭示南極適冷菌Psychrobacter sp.G對極地極端環(huán)境的分子適應機制,闡明假定功能基因在南極適冷菌生境適應性中的作用提供了基礎資料和科學依據(jù)。
【關鍵詞】：適冷菌 轉錄組 假定蛋白 qRT-PCR western blotting
【學位授予單位】：國家海洋局第一海洋研究所
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;Q93
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章 前言13-27
• 1.1 極地微生物研究概況13-14
• 1.2 極地生物對溫度適應性的研究進展14-19
• 1.2.1 冷激/熱激蛋白14-17
• 1.2.2 冷適應蛋白17-19
• 1.2.3 假定蛋白19
• 1.3 基因組學、轉錄組學與假定蛋白基因的發(fā)現(xiàn)19-22
• 1.3.1 基因組學19-20
• 1.3.2 轉錄組學與假定蛋白基因的發(fā)現(xiàn)20-22
• 1.4 假定蛋白的功能探究22-25
• 1.5 目的意義及主要研究內(nèi)容25-27
• 第二章 假定蛋白基因PSYCG_03870的克隆與序列分析及對溫度/鹽度脅迫的響應27-47
• 2.1 材料與方法28-33
• 2.1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑28-29
• 2.1.2 基因組DNA的提取29
• 2.1.3 引物設計與基因全長的獲取29
• 2.1.4 基因序列分析29-30
• 2.1.5 原核表達載體的構建30
• 2.1.5.1 表達載體pET22b和目的基因的連接和轉化30
• 2.1.5.2 重組子的鑒定30
• 2.1.6 重組菌的誘導表達、純化與多克隆抗體的制備30
• 2.1.7 脅迫處理30-31
• 2.1.8 參比基因/蛋白的確定31-32
• 2.1.9 qRT-PCR32
• 2.1.10 Western blotting32-33
• 2.2 結果與分析33-44
• 2.2.1 假定蛋白基因PSYCG_03870的序列分析33-36
• 2.2.2 原核表達載體的構建36-37
• 2.2.3 假定蛋白PSYCG_03870在重組菌中的表達和純化37-38
• 2.2.4 菌株G在不同溫度/鹽度脅迫下的生長曲線38-40
• 2.2.5 在mRNA水平上對溫度/鹽度脅迫的應答特征40-42
• 2.2.6 在蛋白水平上對溫度/鹽度脅迫的應答特征42-44
• 2.3 討論44-45
• 2.4 小結45-47
• 第三章 假定蛋白基因PSYCG_10180的克隆與序列分析及對溫度/鹽度脅迫的響應47-63
• 3.1 材料與方法47-49
• 3.1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑47
• 3.1.2 基因組DNA的提取47
• 3.1.3 引物設計與基因全長的獲取47-48
• 3.1.4 基因序列分析48
• 3.1.5 原核表達載體的構建48
• 3.1.5.1 表達載體pET22b和目的基因的連接和轉化48
• 3.1.5.2 重組子的鑒定48
• 3.1.6 重組菌的誘導表達、純化與多克隆抗體的制備48-49
• 3.1.7 脅迫處理49
• 3.1.8 參比基因/蛋白的確定49
• 3.1.9 qRT-PCR49
• 3.1.10 Western blotting49
• 3.1.11 重組菌株pET22b+ PSYCG_10180的抗凍活性測定49
• 3.2 結果與分析49-60
• 3.2.1 假定蛋白基因PSYCG_10180的序列分析49-53
• 3.2.2 原核表達載體的構建53-54
• 3.2.3 假定蛋白PSYCG_10180在重組菌中的表達和純化54-55
• 3.2.4 在mRNA水平上對溫度/鹽度脅迫的應答特征55-57
• 3.2.5 在蛋白水平上對溫度/鹽度脅迫的應答特征57-59
• 3.2.6 重組菌株的抗凍融活性59-60
• 3.3 討論60-61
• 3.4 小結61-63
• 第四章 假定蛋白基因PSYCG_06740的克隆與序列分析及對溫度/鹽度脅迫的響應63-78
• 4.1 材料與方法63-65
• 4.1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑63
• 4.1.2 基因組DNA的提取63
• 4.1.3 引物設計與基因全長的獲取63-64
• 4.1.4 基因序列分析64
• 4.1.5 原核表達載體的構建64
• 4.1.6 重組菌的誘導表達、純化與多克隆抗體的制備64-65
• 4.1.7 脅迫處理65
• 4.1.8 參比基因/蛋白的確定65
• 4.1.9 qRT-PCR65
• 4.1.10 Western blotting65
• 4.2 結果與分析65-75
• 4.2.1 假定蛋白基因PSYCG_06740的序列分析65-69
• 4.2.2 原核表達載體的構建69-70
• 4.2.3 假定蛋白PSYCG_06740在重組菌中的表達和純化70-71
• 4.2.4 在mRNA水平上對溫度/鹽度脅迫的應答特征71-73
• 4.2.5 在蛋白水平上對溫度/鹽度脅迫的應答特征73-75
• 4.3 討論75-77
• 4.4 小結77-78
• 第五章 總結與展望78-81
• 5.1 總結78-79
• 5.2 展望79-81
• 參考文獻81-91
• 附錄91-93
• 碩士期間發(fā)表文章93-95
• 致謝95

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本文編號：751114