本文關(guān)鍵詞：桂花CHS、DFR基因全長(zhǎng)克隆、表達(dá)分析及表達(dá)載體構(gòu)建

  更多相關(guān)文章： 桂花 查爾酮合成酶 二氫黃酮醇還原酶 克隆 表達(dá)分析

【摘要】：桂花(Osmanthus fragrans Lour.)又名木犀,是我國(guó)十大名花之一,在園林應(yīng)用上占有重要地位。根據(jù)其花色差異將桂花分為四個(gè)品種群,但種群間花色變異相對(duì)較小,主要為黃色和橙紅色,缺乏藍(lán)色等新奇花色,這在一定程度上限制了其觀賞價(jià)值�；ㄉ剀帐侵参矬w內(nèi)最為重要的水溶性色素,其最重要的功能是賦予植物繽紛的色彩。目前其合成途徑與調(diào)控機(jī)制都得到了充分的了解。CHS、DFR基因作為該途徑當(dāng)中兩個(gè)關(guān)鍵基因已在多種植物中進(jìn)行了克隆研究,但在桂花當(dāng)中,其基因結(jié)構(gòu)以及對(duì)桂花花色的形成所起到的調(diào)控作用尚未有報(bào)道,值得進(jìn)行更為深入的探究。本實(shí)驗(yàn)以桂花橙紅丹桂品種為試材,采用RT-PCR和RACE方法克隆丹桂查耳酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因以及二氫黃酮醇-4-還原酶(Dihydvroflavonol-4-reductase,DFR)基因cDNA全長(zhǎng)。利用NCBI和DNAMAN分析軟件對(duì)該基因進(jìn)行核苷酸序列以及氨基酸序列的分析,利用DNAMAN軟件直接構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析該基因在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系。以橙紅丹桂與籽銀桂品種不同花期的樣品為試材,采用熒光定量PCR和2-ΔΔCT法定量分析兩個(gè)基因在不同花期的表達(dá)量。研究結(jié)果如下:(1)從橙紅丹桂花瓣中成功獲得了一個(gè)丹桂查耳酮合成酶基因cDNA全長(zhǎng),該基因全長(zhǎng)為1383 bp,包含48 bp的5′非編碼區(qū)、162 bp的3′非編碼區(qū)和一個(gè)長(zhǎng)度為1173bp編碼390個(gè)氨基酸的開放閱讀框。序列分析表明該基因具有Cysl64、His303和Asn3363個(gè)活性位點(diǎn)及2個(gè)決定底物特異性的苯丙氨酸殘基Phe215、Phe265。該基因也具有查爾酮合成酶家族的兩條特征多肽序列:RFMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL。Blast序列分析顯示該基因與同屬木犀科的油橄欖相似性達(dá)92%,與其他雙子葉植物的相似性在72%-76%左右。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,該基因聚類具有明顯的種屬特性,桂花與唇形科等植物的CHS親緣關(guān)系較近,相似性達(dá)76%以上,符合植物分類學(xué)分類,為今后探究該基因在花色形成中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)進(jìn)行熒光定量PCR結(jié)果顯示,OfCHS基因在桂花的花瓣及葉片中均有表達(dá),且在葉片中的相對(duì)表達(dá)量為初花期花瓣表達(dá)量的38倍,在橙紅丹桂中隨著花期,表達(dá)量呈現(xiàn)明顯的先增后減的趨勢(shì),而在銀桂品種中,在初花期表達(dá)量最高,而后逐漸降低。(2)從桂花(Osmanthus fragrans)花瓣中成功克隆了一個(gè)二氫黃酮醇-4-還原酶(Dihydvroflavonol-4-reductase,DFR)基因OfDFR全長(zhǎng)(基因序列號(hào):KR604812)。序列分析表明,該基因全長(zhǎng)為1214bp,包含一個(gè)長(zhǎng)度為1131bp編碼376個(gè)氨基酸的開放閱讀框,預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為99.68KD,等電點(diǎn)為4.98。功能域結(jié)構(gòu)分析表明,該基因具有典型的DFR蛋白結(jié)構(gòu)功能域,屬于NADBRossmann超基因家族。進(jìn)行同源性分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,該基因在物種間的相似性較高;其中,桂花OfDFR基因與同屬木犀科的連翹FiDFR基因親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR分析表明,OfDFR在桂花葉片與花瓣中均有表達(dá),且花瓣中的表達(dá)水平顯著低于葉片;在不同開花時(shí)期的花瓣中,Of DFR基因的表達(dá)呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì);該結(jié)果為進(jìn)一步探究DFR基因在桂花花色形成中的功能與作用奠定理論基礎(chǔ)。(3)將得到的兩個(gè)基因全長(zhǎng)分別與PBI121表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體,分別命名為35S”:OfCHS、35S”:OfDFR,并利用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)。
【關(guān)鍵詞】：桂花 查爾酮合成酶 二氫黃酮醇還原酶 克隆 表達(dá)分析
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S685.13;Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-19
• 1.1 花色苷的研究13-18
• 1.1.1 花色苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)和種類13-14
• 1.1.2 花色苷的研究歷程和進(jìn)展14-16
• 1.1.3 花色苷合成相關(guān)基因16-18
• 1.2 本研究的目的意義18-19
• 2 試驗(yàn)材料與方法19-35
• 2.1 試驗(yàn)材料19-22
• 2.1.1 植物材料19-20
• 2.1.2 菌株和質(zhì)粒20
• 2.1.3 試驗(yàn)藥品及試劑20
• 2.1.4 主要試劑配制及RNA提取物品的處理20-21
• 2.1.5 主要儀器及設(shè)備21-22
• 2.2 試驗(yàn)方法22-35
• 2.2.1 桂花花瓣及葉片總RNA的提取22-23
• 2.2.1.1 采用改良的CTAB法提取總RNA22-23
• 2.2.1.2 Trizol法提取桂花總RNA23
• 2.2.2 總RNA質(zhì)量檢測(cè)23-24
• 2.2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳法23-24
• 2.2.2.2 紫外吸收法24
• 2.2.3 反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成24-25
• 2.2.4 中間片段的擴(kuò)增25-27
• 2.2.4.1 引物的設(shè)計(jì)25
• 2.2.4.2 PCR擴(kuò)增25
• 2.2.4.3 目的條帶切膠回收25-26
• 2.2.4.4 目的基因的連接與轉(zhuǎn)化26
• 2.2.4.5 目的基因的轉(zhuǎn)化26-27
• 2.2.4.6 陽(yáng)性克隆的鑒定27
• 2.2.4.7 中間片段的測(cè)序27
• 2.2.5 5′序列的獲得27-30
• 2.2.6 3′序列的獲得30
• 2.2.7 全長(zhǎng)拼接30
• 2.2.8 OfCHS與OfDFR基因理化性質(zhì)的分析30-31
• 2.2.9 基因表達(dá)量的測(cè)定31-32
• 2.2.10 表達(dá)載體的構(gòu)建32-34
• 2.2.11 凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌34
• 2.2.12 擬南芥的轉(zhuǎn)化、篩選與鑒定34-35
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析35-55
• 3.1 總RNA的提取35
• 3.2 OfCHS和OfDFR基因全長(zhǎng)的克隆及序列分析35-52
• 3.2.1 OfCHS基因全長(zhǎng)的克隆35-37
• 3.2.1.1 OfCHS基因中間片段的克隆35-36
• 3.2.1.2 OfCHS基因全長(zhǎng)的獲得36-37
• 3.2.2 OfCHS基因序列分析37-44
• 3.2.2.1 OfCHS全長(zhǎng)序列分析：37-39
• 3.2.2.2 OfCHS基因理化性質(zhì)的分析39-44
• 3.2.3 OfDFR基因全長(zhǎng)的克隆44-47
• 3.2.3.1 5′序列的獲得44
• 3.2.3.2 3′序列的獲得44-45
• 3.2.3.3 全長(zhǎng)拼接45-47
• 3.2.4 桂花OfDFR蛋白的生物信息學(xué)分析47-52
• 3.3 基因的組織表達(dá)特性分析52-54
• 3.3.1 OfCHS、OfDFR在桂花不同器官及花期中的表達(dá)52-53
• 3.3.2 OfCHS、OfDFR在在桂花不同品種花瓣的表達(dá)53-54
• 3.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定54-55
• 4 討論55-57
• 4.1 查爾酮合成酶基因的功能55-56
• 4.2 查爾酮合成酶基因與桂花花色相關(guān)性的探究56
• 4.3 二氫黃酮醇還原酶基因的功能56
• 4.4 二氫黃酮醇還原酶基因與桂花花色相關(guān)性的探究56-57
• 5 結(jié)論57-60
• 參考文獻(xiàn)60-65
• 致謝65-66
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文66

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 覃仁娟;百合DFR基因克隆及功能初步鑒定[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 徐秀榮;桂花CHS、DFR基因全長(zhǎng)克隆、表達(dá)分析及表達(dá)載體構(gòu)建[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：749002