本文關(guān)鍵詞：小麥西農(nóng)538幾丁質(zhì)酶基因的克隆、表達(dá)及功能分析

  更多相關(guān)文章： 西農(nóng)538 幾丁質(zhì)酶 原核表達(dá) 組織表達(dá) 功能分析

【摘要】：幾丁質(zhì)酶是植物重要的防衛(wèi)因子之一,與植物的抗病性密切相關(guān)。為了進(jìn)一步擴(kuò)充幾丁質(zhì)酶基因資源,深入了解其在小麥體內(nèi)的表達(dá)特性及其功能,本研究利用通用引物ChiF/ChiR從不同的小麥材料中,克隆得到幾丁質(zhì)酶基因并對(duì)序列進(jìn)行分析,與表達(dá)載體連接在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),并利用熒光定量PCR (qRT-PCR)技術(shù)分析這些基因在西農(nóng)538小麥根、莖和葉等不同組織中的表達(dá)情況。最后,選取在西農(nóng)538小麥的根、莖和葉組織中表達(dá)量較高的2個(gè)幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)一步研究其與條銹病菌的抗性反應(yīng)試驗(yàn)。結(jié)果表明：1.從10份具有不同抗病性的小麥材料中,均能夠克隆得到5條長度約960 bp的幾丁質(zhì)酶基因序列,依次命名為Cht1、Cht2、Cht3、Cht4和Cht5。利用NCBI在線BLAST軟件對(duì)這5條基因序列進(jìn)行同源性比對(duì),結(jié)果搜索到100條具有同源性的核苷酸序列,其中Cht5與來自于中國春的Chi-3基因(序列號(hào)KJ507387)完全一致,進(jìn)而將剩余基因提交至GenBank,獲得登錄號(hào)為KR049247～KR049250。2.對(duì)新擴(kuò)增到的Cht1～Cht4基因序列進(jìn)行分析表明,這些基因均具有完整的開放閱讀框,不含內(nèi)含子,起始密碼子均為ATG,終止密碼子都是TAG。Chtl～Cht4的核苷酸和氨基酸序列之間的相似性分別為96.84%和91.02%。這四條基因編碼的幾丁質(zhì)酶均屬于親水性蛋白,按照不同的分類方法,這些幾丁質(zhì)酶分別屬于Class Ⅰ b類型,同時(shí)也屬于糖苷水解酶第19家族,是胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。將獲得的4條氨基酸序列與NCBI中已知來源的不同類型的幾丁質(zhì)酶蛋白序列進(jìn)行比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,聚類結(jié)果顯示,本研究中得到的幾丁質(zhì)酶屬于Class Ⅰ型。3.SDS-PAGE分析表明,這四條基因?qū)?yīng)的重組質(zhì)粒均能夠在表達(dá)菌株TranBL21(DE3)中以包涵體的形式表達(dá)一個(gè)33 kDa左右的特異蛋白,與目標(biāo)蛋白大小一致。4. qRT-PCR分析表明,這5個(gè)幾丁質(zhì)酶基因均能夠在西農(nóng)538的根、莖和葉中組成型表達(dá),但在不同組織中具有較大的表達(dá)差異：葉中表達(dá)量最高,根次之,莖中的表達(dá)量最低；同時(shí),這5種幾丁質(zhì)酶基因在同一組織中的表達(dá)量也具有明顯規(guī)律性：Cht4 Cht2Cht3Cht1Chi-3。說明本研究擴(kuò)增到的幾丁質(zhì)酶基因可能參與了小麥的正常生長發(fā)育過程。5.選取相對(duì)表達(dá)量較高的Cht4基因和Cht2基因進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)真菌性病害的抗性反應(yīng),結(jié)果表明,這兩個(gè)基因的表達(dá)均可以受到條銹病菌的誘導(dǎo),并且Cht4基因表達(dá)量與Cht2基因相比更早的出現(xiàn)峰值。Cht4基因在高抗材料92R137中的表達(dá)量顯著高于中抗材料西農(nóng)538和感病材料銘賢169,并且均高于同等條件下接ddH20的表達(dá)量；Cht2基因在中抗材料西農(nóng)538中的表達(dá)量顯著高于高抗材料92R137和感病材料銘賢169,并且抗病材料中的基因表達(dá)量高于對(duì)照中表達(dá)量,但在感病材料銘賢169中該基因表達(dá)與對(duì)照差別不大。說明Cht4基因和Cht2基因可能參與了小麥葉部抗條銹菌的防御反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：西農(nóng)538 幾丁質(zhì)酶 原核表達(dá) 組織表達(dá) 功能分析
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S512.1;Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-20
• 1.1 幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)特性12-13
• 1.2 幾丁質(zhì)酶的分布定位13
• 1.3 幾丁質(zhì)酶的分類13-15
• 1.3.1 根據(jù)系統(tǒng)分類法分類13-14
• 1.3.2 基于水解位點(diǎn)分類14
• 1.3.3 根據(jù)等電點(diǎn)分類14
• 1.3.4 根據(jù)催化部位氨基酸序列分類14
• 1.3.5 根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類14-15
• 1.4 幾丁質(zhì)酶的生物學(xué)作用15-17
• 1.4.1 參與植物的發(fā)育調(diào)控15-16
• 1.4.2 抑制真菌菌絲生長和孢子萌發(fā)16
• 1.4.3 參與共生固氮16
• 1.4.4 釋放信號(hào)分子16
• 1.4.5 抑制細(xì)菌生長和分裂、蟲類消化和發(fā)育16-17
• 1.5 植物幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展17-19
• 1.5.1 植物幾丁質(zhì)酶的體外抑菌研究17
• 1.5.2 植物幾丁質(zhì)酶的可誘導(dǎo)性17-18
• 1.5.3 植物幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因研究18
• 1.5.4 小麥幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展18-19
• 1.6 本研究的目的及意義19-20
• 第二章 西農(nóng)538幾丁質(zhì)酶基因的克隆及序列分析20-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料及其他20-21
• 2.1.1 植物材料20
• 2.1.2 儀器和設(shè)備20
• 2.1.3 試劑和培養(yǎng)基20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-23
• 2.2.1 基因組DNA的提取21-22
• 2.2.2 目的基因的擴(kuò)增及回收22
• 2.2.3 目的基因的克隆22-23
• 2.2.4 目的基因的生物信息學(xué)分析23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析23-30
• 2.3.1 幾丁質(zhì)酶基因的克隆23-24
• 2.3.2 核酸序列分析24-25
• 2.3.3 氨基酸序列分析25-27
• 2.3.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析27-30
• 第三章 西農(nóng)538幾丁質(zhì)酶基因的原核表達(dá)及目的蛋白的鑒定30-35
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料及其他30-31
• 3.1.1 載體及菌株30
• 3.1.2 儀器和設(shè)備30
• 3.1.3 相關(guān)試劑30-31
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法31-33
• 3.2.1 提取質(zhì)粒31
• 3.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建31-32
• 3.2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)32
• 3.2.4 原核表達(dá)產(chǎn)物溶解性鑒定32-33
• 3.2.5 原核表達(dá)產(chǎn)物的純化33
• 3.3 結(jié)果與分析33-35
• 3.3.1 原核載體構(gòu)建及目的蛋白檢測33-34
• 3.3.2 原核表達(dá)產(chǎn)物溶解性鑒定34
• 3.3.3 原核表達(dá)產(chǎn)物的純化34-35
• 第四章 西農(nóng)538幾丁質(zhì)酶基因的組織表達(dá)及功能分析35-41
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料及其他35
• 4.1.1 植物材料35
• 4.1.2 儀器和設(shè)備35
• 4.1.3 相關(guān)試劑(盒)35
• 4.2 試驗(yàn)方法35-38
• 4.2.1 樣品采集35-36
• 4.2.2 RNA提取及RT-PCR36-38
• 4.3 結(jié)果與分析38-41
• 4.3.1 西農(nóng)538幾丁質(zhì)酶基因的組織表達(dá)特性38-39
• 4.3.2 Cht4基因和Cht2基因在條銹菌侵染后的表達(dá)特性39-41
• 第五章 討論與結(jié)論41-44
• 5.1 討論41-43
• 5.1.1 西農(nóng)538幾丁質(zhì)酶基因的克隆及序列分析41
• 5.1.2 西農(nóng)538幾丁質(zhì)酶基因的原核表達(dá)41-42
• 5.1.3 西農(nóng)538幾丁質(zhì)酶基因的組織表達(dá)特性分析42
• 5.1.4 Cht4基因和Cht2基因在條銹菌侵染后表達(dá)特性分析42-43
• 5.2 結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-49
• 致謝49-50
• 作者簡介50

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 Pink shirt ,Dollday;銀 第二部分(一)[J];科學(xué)之友;2006年10期

2 張明;;陜西農(nóng)網(wǎng)與農(nóng)村綜合信息服務(wù)[J];陜西氣象;2007年06期

3 武會(huì)娟;羅軍;張麗娟;韓雪峰;楊寶進(jìn);王海濱;單翠燕;張寧;余剛;;西農(nóng)薩能羊兩個(gè)泌乳階段差異表達(dá)基因SAA3的克隆和序列分析[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2007年02期

4 黨云萍,王延峰,常海飛,王富剛;赤霉素對(duì)西農(nóng)早蜜桃果實(shí)發(fā)育的影響[J];延安大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2003年02期

5 安晨;;中國克隆基地探秘[J];僑園;2001年05期

6 ;[J];;年期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 景憶蓮;田志誠;劉耀斌;冀煒;;雜交棉西農(nóng)棉35的選育及栽培要點(diǎn)[A];中國棉花學(xué)會(huì)2009年年會(huì)論文匯編[C];2009年

2 趙旺生;羅軍;王偉;郝娟;滕炎玲;;西農(nóng)薩能羊ADRP基因CDS區(qū)的克隆及序列分析[A];中國動(dòng)物遺傳育種研究進(jìn)展——第十五次全國動(dòng)物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2009年

3 朱江江;羅軍;趙旺生;王偉;石恒波;李君;;西農(nóng)薩能羊脂肪酸合酶基因乙酰/丙二酸單酰基轉(zhuǎn)移酶區(qū)域重組腺病毒載體的構(gòu)建[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)養(yǎng)羊?qū)W分會(huì)全國養(yǎng)羊生產(chǎn)與學(xué)術(shù)研討會(huì)議論文集[C];2010年

4 孫爽;羅軍;李芳;朱江江;王維;;不同培育方案對(duì)西農(nóng)薩能羊羔羊生長發(fā)育的影響[A];《2011中國羊業(yè)進(jìn)展》論文集[C];2011年

5 林先滋;羅軍;趙旺生;王偉;;西農(nóng)薩能羊脂肪酸代謝相關(guān)miRNA的篩選與miR-103-1的克隆驗(yàn)證[A];中國動(dòng)物遺傳育種研究進(jìn)展——第十五次全國動(dòng)物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2009年

6 余康;羅軍;孫爽;姚大維;吳敏;;日糧蛋白水平對(duì)不同性別1～100日齡西農(nóng)薩能羊生長發(fā)育及血液生化指標(biāo)的影響[A];2012中國羊業(yè)進(jìn)展論文集[C];2012年

7 吳敏;羅軍;姚大為;余康;張偉;;日糧中不同蛋白質(zhì)和L-賴氨酸水平對(duì)西農(nóng)薩能羊泌乳性能和血漿生化指標(biāo)的影響[A];2012中國羊業(yè)進(jìn)展論文集[C];2012年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 通訊員 靳軍 記者 王曉陽;小麥新品種“西農(nóng)928”大旱之年創(chuàng)高產(chǎn)[N];陜西日?qǐng)?bào);2013年

2 王林濤 黃少虔;西農(nóng)979小麥[N];河南科技報(bào);2006年

3 本報(bào)記者 石元清;西農(nóng)大市場6.4萬元兌現(xiàn)補(bǔ)貼承諾[N];樂山日?qǐng)?bào);2010年

4 魏嶸;陜西發(fā)布小麥秋播布局建議[N];陜西科技報(bào);2007年

5 本報(bào)記者 王拉田;種良種小麥 享政府補(bǔ)貼[N];寶雞日?qǐng)?bào);2011年

6 郭士英;優(yōu)質(zhì)抗病小麥 西農(nóng)9430[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2002年

7 駐站記者 郭景超;林西農(nóng)發(fā)行扶持冷山公司走出低谷穩(wěn)健發(fā)展[N];赤峰日?qǐng)?bào);2009年

8 程偉;番茄新品種“西農(nóng)2011”通過省級(jí)鑒定[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2011年

9 記者 程偉;我省番茄新品種“西農(nóng)2011”通過省級(jí)鑒定[N];陜西日?qǐng)?bào);2011年

10 本報(bào)記者 王拉田;種一畝良種小麥獲10元國家補(bǔ)貼[N];寶雞日?qǐng)?bào);2012年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 閆林;大穗小麥西農(nóng)9814主要性狀遺傳分析及性狀改良研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李杰;行動(dòng)者網(wǎng)絡(luò)理論視角下“西農(nóng)模式”實(shí)現(xiàn)研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

2 陳冬陽;小麥西農(nóng)538幾丁質(zhì)酶基因的克隆、表達(dá)及功能分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

3 卓小平;西農(nóng)優(yōu)10號(hào)與Ⅱ優(yōu)838光合特性、株型和密肥影響的比較研究[D];西南大學(xué);2010年

4 雷亞柯;西農(nóng)9814的生產(chǎn)利用及遺傳改良研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

5 宋美麗;西農(nóng)979品質(zhì)性狀的肥力效應(yīng)及其調(diào)優(yōu)高產(chǎn)技術(shù)研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

6 王海濱;西農(nóng)薩能羊乳腺脂肪酸合酶（FAS）基因及其啟動(dòng)子的克隆、測序與分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

7 李晶;小麥的轉(zhuǎn)基因研究和兩種荒漠植物的離體再生[D];西北大學(xué);2003年

8 閆佳;氮素水平對(duì)冬小麥鋅、鐵吸收積累和產(chǎn)量的影響[D];河南科技大學(xué);2015年

9 楊地坤;不同培育方案對(duì)西農(nóng)薩能羊羔羊生長發(fā)育及血液生化指標(biāo)的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

10 郝娟;西農(nóng)薩能羊TIP47基因的克隆分析與RNA干擾研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2011年

，

本文編號(hào)：738109