發(fā)布時間：2017-08-25 06:16

  本文關(guān)鍵詞：巨噬細(xì)胞吞噬功能關(guān)鍵調(diào)控基因篩選技術(shù)的建立與應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： CRISPR 巨噬細(xì)胞 吞噬功能 全基因組篩選

【摘要】：巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)重要的組成部分,能夠吞噬和殺滅細(xì)菌、寄生蟲、腫瘤細(xì)胞以及自身衰老和死亡的細(xì)胞等,并能發(fā)揮機(jī)體的免疫防御、免疫自穩(wěn)、免疫監(jiān)視等功能。巨噬細(xì)胞廣泛分布于全身各個組織,由單核細(xì)胞分化而來,成熟的單核細(xì)胞通過血管內(nèi)皮遷移至不同組織中,分化成組織特異性的巨噬細(xì)胞。如肝、脾、肺、神經(jīng)中樞組織、骨及結(jié)締組織中,組織特異性的巨噬細(xì)胞均會通過不同的途徑行使功能。以肺泡巨噬細(xì)胞為例,當(dāng)致病物入侵時,肺泡巨噬細(xì)胞表面的模式識別受體(PRR)——Toll樣受體(Toll-like-receptor)會與相應(yīng)配體的結(jié)合進(jìn)而上調(diào)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。模式識別受體(PRR)對于巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬功能尤為重要,其主要通過識別致病物的特異性區(qū)域,進(jìn)而將致病物吞噬消化。巨噬細(xì)胞表面的模式識別受體主要有三類,第一類的主要功能是作為激活補(bǔ)體,如mac1;第二類受體能夠結(jié)合并吞噬抗原,如toll-like受體;第三類受體具有信號分子性質(zhì),它們被激活后能夠影響基因轉(zhuǎn)錄活性。巨噬細(xì)胞的吞噬功能對于其發(fā)揮免疫防御作用十分關(guān)鍵。根據(jù)目前的研究顯示,巨噬細(xì)胞的吞噬功能與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)。比如神經(jīng)退行性疾病,目前認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制具有十分關(guān)鍵的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞能清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中受損的神經(jīng)、凋亡的細(xì)胞以及斑塊等物質(zhì),若清除功能異常,則會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。但有關(guān)巨噬細(xì)胞吞噬功能的關(guān)鍵調(diào)控分子及機(jī)制目前仍不明確,我們實驗室始終關(guān)注巨噬細(xì)胞的研究,計劃在全基因組水平進(jìn)行一項有關(guān)調(diào)控細(xì)胞吞噬功能的關(guān)鍵基因的篩選工作,為后續(xù)的機(jī)制研究提供線索和思路。2013年CRISPR技術(shù)的出現(xiàn)為篩選工作帶來了極大的便利。CRISPR/Cas9技術(shù)是近年興起的革命性的新型基因組編輯技術(shù),該技術(shù)可在細(xì)胞水平實現(xiàn)高效的基因編輯。CRISPR/Cas9技術(shù)的多功能及可編程特點(diǎn),令其可以更快的構(gòu)建小鼠的疾病模型,同時在遺傳性疾病、惡性腫瘤等許多疾病的研究、治療及預(yù)防方面均顯示出巨大的應(yīng)用潛力。隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的不斷優(yōu)化,目前此項技術(shù)已在科研、醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域上被廣泛應(yīng)用。為了便于科研人員進(jìn)行科學(xué)研究,處于該技術(shù)前沿領(lǐng)域的研究小組通過Addgene公司向研究人員提供了多種CRISPR/Cas9體系及全基因組文庫。因此我們擬基于CRISPR全基因組文庫進(jìn)行巨噬細(xì)胞吞噬調(diào)控關(guān)鍵基因的篩選。進(jìn)行篩選實驗需要具備最基本的兩個條件:1.涵蓋足夠基因的文庫;2.易于操作和分析的篩選體系。根據(jù)實驗需求,我們選取了由Zhang Feng實驗室提供的小鼠CRISPR全基因組文庫,此文庫涵蓋了20611個小鼠基因,同時設(shè)計了1000條無關(guān)序列的sgRNA。篩選實驗的另一項關(guān)鍵因素是篩選體系的建立。我們設(shè)計篩選體系的原則是篩選結(jié)果便于觀察及驗證。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研,我們選用Clodronate-Liposomes作為篩選試劑,建立了巨噬細(xì)胞吞噬功能調(diào)控關(guān)鍵基因的篩選體系。clodronate-liposomes是利用脂質(zhì)體將clodronate包裹在內(nèi),被具有吞噬能力的細(xì)胞吞噬后,在胞內(nèi)溶酶體作用下,將脂質(zhì)體降解并釋放出clodronate,使其在細(xì)胞內(nèi)累積,并生成具有毒性作用的atp類似物。理論上只有具備吞噬能力的細(xì)胞才能吞噬clodronate-liposomes,并且當(dāng)clodronate在巨噬細(xì)胞內(nèi)累積至一定的濃度時,細(xì)胞便會死亡。但如果調(diào)控吞噬的基因缺失,細(xì)胞失去吞噬能力,不再吞噬clodronate-liposomes,那么細(xì)胞便會存活。因此我們可以利用clodronate-liposomes,通過存活的細(xì)胞,篩選出吞噬功能缺失的細(xì)胞,并進(jìn)一步通過細(xì)胞基因組的深度測序鑒定調(diào)控吞噬功能的關(guān)鍵基因。根據(jù)以上原理,我們首先建立了細(xì)胞篩選體系。1.確定clodronate-liposomes是否特異性的只對具有吞噬能力的的細(xì)胞致死以及clodronate-liposomes對ibmm細(xì)胞的最低致死劑量。為驗證clodronate-liposomes是否特異性的只對具有吞噬能力的的細(xì)胞致死,我們設(shè)計實驗如下:將clodronate-liposomes分別加入到具有吞噬能力的ibmm細(xì)胞、不具有吞噬能力的hela細(xì)胞、l929細(xì)胞以及hek293細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)只有ibmm細(xì)胞出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象,其余細(xì)胞生長狀態(tài)均無影響;通過設(shè)置濃度梯度實驗,利用臺盼藍(lán)染色法觀察細(xì)胞的存活情況,確定篩選實驗中使用的clodronate-liposomes最低致死劑量為700μm。2.crispr全基因組文庫病毒成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后,細(xì)胞便具有puro抗性,因此需要確定puro對細(xì)胞的最低有效劑量。通過設(shè)置濃度梯度實驗,確定篩選實驗中使用的puro最低有效劑量為1.5μg/ml。篩選實驗的另一項關(guān)鍵要素是擴(kuò)增出完整的基因組文庫。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研,為保證文庫擴(kuò)增的完整性,此文庫對感受態(tài)的轉(zhuǎn)化率要求到達(dá)109cfu/μg,因此我們引進(jìn)了超級感受態(tài),此感受態(tài)菌的轉(zhuǎn)化效率高達(dá)2×1010cfu/μg。我們利用電轉(zhuǎn)超級感受態(tài)的方法,將crispr小鼠全基因組文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)化,根據(jù)轉(zhuǎn)化實驗中檢測板的克隆數(shù)計算,我們擴(kuò)增的總克隆數(shù)大約為3×107,超過了完整擴(kuò)增文庫的標(biāo)準(zhǔn)3×106,為后續(xù)實驗做好了準(zhǔn)備。文庫擴(kuò)增后,在hek293細(xì)胞中進(jìn)行crispr文庫病毒的包裝。為保證每一個細(xì)胞只敲除一個基因,根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研,當(dāng)moi接近0.3時,滿足上述要求,因此我們需要確定病毒的滴度。我們利用pi染色法檢測crispr文庫病毒滴度,選擇moi接近0.3時的病毒體積進(jìn)行ibmm細(xì)胞感染。成功感染ibmm細(xì)胞后,用含有puro的dmem完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞2周后,存活的細(xì)胞即為文庫細(xì)胞。將文庫細(xì)胞部分留存,部分細(xì)胞使含有clodronate-liposomes的培養(yǎng)基培養(yǎng),同時設(shè)置一組野生型細(xì)胞作為對照組,連續(xù)加clodronate-liposomes培養(yǎng)2天后,使用正常的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞7天,然后將存活的細(xì)胞收集,此時存活細(xì)胞即為篩選細(xì)胞。為進(jìn)一步證明篩選實驗體系的可靠性,取部分篩選細(xì)胞和文庫細(xì)胞,分別用bioparticle和gfp-e.coli進(jìn)行細(xì)胞吞噬能力的驗證,結(jié)果顯示篩選組細(xì)胞的吞噬能力明顯下降。取部分篩選細(xì)胞和文庫細(xì)胞提取基因組,進(jìn)行深度測序。根據(jù)基因的富集度和軟件評分情況,我們將測序結(jié)果進(jìn)行了整理分析,發(fā)現(xiàn)排位前100個基因中,部分已知影響巨噬細(xì)胞吞噬能力的基因位列其中,比如:NFκB1、Serpinb9d、CD63、Fgfr2,同時測序結(jié)果中存在很多功能未知基因,這部分基因?qū)⑹俏覀兿乱徊街攸c(diǎn)研究的對象。綜上,巨噬細(xì)胞發(fā)揮其免疫功能時,其吞噬功能是不可或缺的。本項研究成功應(yīng)用Clodronate-Liposomes作為篩選試劑,以CRISPR小鼠全基因文庫為基礎(chǔ),創(chuàng)新性地建立了巨噬細(xì)胞調(diào)控吞噬功能基因的篩選體系。此篩選方法基本涵蓋了小鼠的全基因組,篩選結(jié)果便于觀察及驗證,即存活下來的細(xì)胞可能是調(diào)控吞噬基因缺失的細(xì)胞。并且通過深度測序,我們初步得到了可能影響吞噬功能的基因,為進(jìn)一步探索巨噬細(xì)胞吞噬調(diào)控的機(jī)制奠定了基礎(chǔ),并為吞噬功能異常所致疾病的治療提供了新的思路和科學(xué)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：CRISPR 巨噬細(xì)胞 吞噬功能 全基因組篩選
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392;Q78
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 實驗材料與方法15-22
• 1.材料與來源15-17
• 1.1 菌株與CRISPR基因編輯文庫15
• 1.2 主要試劑15-16
• 1.3 實驗儀器16
• 1.4 主要試劑配方16-17
• 2.實驗方法17-22
• 2.1 建立篩選體系方法17
• 2.2 CRISPR文庫擴(kuò)增17-18
• 2.3 提取CRISPR文庫18
• 2.4 篩選實驗18-20
• 2.5 細(xì)胞吞噬能力驗證實驗20-21
• 2.6 提取細(xì)胞基因組21
• 2.7 基因組深度測序21-22
• 實驗結(jié)果22-31
• 1.建立篩選體系方法22-24
• 1.1 Clodronate-Liposomes吞噬致死實驗22
• 1.2 Clodronate-Liposomes最低致死劑量22-24
• 1.3 Puromycin最低有效劑量24
• 2.擴(kuò)增CRISPR文庫24
• 3.檢測文庫病毒滴度24-26
• 4.篩選文庫陽性克隆26
• 5.利用Clodronate-Liposomes篩選吞噬功能異常細(xì)胞26-27
• 6.驗證篩選細(xì)胞的吞噬能力27-29
• 6.1 應(yīng)用Bioparticle驗證篩選細(xì)胞吞噬能力27-28
• 6.2 應(yīng)用熒光標(biāo)記的E.coli驗證篩選細(xì)胞吞噬能力28-29
• 7.基因組測序結(jié)果29-31
• 討論31-33
• 總結(jié)33-34
• 參考文獻(xiàn)34-39
• 個人簡歷39-40
• 致謝40-41

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