本文關(guān)鍵詞：玉米大斑病菌漆酶基因Stlac2結(jié)構(gòu)分析及原核表達(dá)

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【摘要】：【目的】對(duì)玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)漆酶基因Stlac2進(jìn)行生物信息學(xué)分析,推測(cè)其蛋白功能,探究木質(zhì)素降解過程中產(chǎn)生的小分子物質(zhì)對(duì)Stlac2表達(dá)的影響,并對(duì)其進(jìn)行克隆及原核表達(dá),以便深入研究該基因在病菌生長(zhǎng)、發(fā)育及致病過程中的作用。【方法】通過NCBI查詢獲得玉米大斑病菌EOA90070(Stlac2)基因的全序列,通過Clustal X與馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)PbrB(PMAA_082060)基因、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)Abr2(AFUA_2G17530)基因、構(gòu)巢曲菌(Aspergillus nidulans)YA(AN6635)基因等漆酶家族基因進(jìn)行蛋白序列比對(duì),查看Stlac2中的銅離子結(jié)合位點(diǎn),利用在線軟件SOPMA和ProtParam對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),通過SWISS-MODEL對(duì)Stlac2蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),采用SAVES對(duì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過對(duì)ABTS的氧化試驗(yàn)確定木質(zhì)素降解過程中產(chǎn)生的小分子物質(zhì)對(duì)玉米大斑病菌漆酶產(chǎn)量的影響;利用RT-qPCR方法分析小分子物質(zhì)對(duì)Stlac2表達(dá)規(guī)律的影響;采用原核表達(dá)系統(tǒng),以pET-30a表達(dá)載體為框架,對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá),并將表達(dá)蛋白純化,以ABTS為底物,420 nm下檢測(cè)漆酶活性。【結(jié)果】Stlac2具有典型的Cu離子結(jié)合位點(diǎn),與漆酶典型的Cu離子結(jié)構(gòu)域相似。其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲所占比例分別為18.59%、25.63%、11.91%和43.86%,分子量為61.64 k D,等電點(diǎn)為5.00,平均疏水性為-0.37,表明其為親水蛋白。當(dāng)在PDA中添加0.01 g·L~(-1)香草醛、4-羥基苯甲醛、丁香醛、香草酸、4-羥基苯甲酸和香蘭素時(shí),玉米大斑病菌胞外漆酶的產(chǎn)量為香草酸香蘭素4-羥基苯甲醛4-羥基苯甲酸丁香醛對(duì)照。而在4-羥基苯甲醛和4-羥基苯甲酸存在時(shí),玉米大斑病菌Stlac2的相對(duì)表達(dá)量明顯升高,約為對(duì)照的5—8倍。利用原核表達(dá)系統(tǒng),在67 k D處成功誘導(dǎo)表達(dá)出一條特異性蛋白條帶,大量表達(dá)純化后,漆酶活性為(40.7±0.3)U·L~(-1)�！窘Y(jié)論】闡明了Stlac2的生物信息學(xué)特性,初步斷定其為漆酶基因;4-羥基苯甲醛和4-羥基苯甲酸可顯著提高Stlac2相對(duì)表達(dá)量,表明其在木質(zhì)素降解過程中起到了一定的作用;該基因所編碼的蛋白可通過pET-30a原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá),體外漆酶活性可達(dá)(40.7±0.3)U·L~(-1),該研究結(jié)果為后期研究蛋白性質(zhì)打下了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： 玉米大斑病菌 Stlac 生物信息學(xué)分析 RT-qPCR 原核表達(dá)
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(31101402) 國(guó)家玉米產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-02-12) 河北省高等學(xué)�？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(ZD2014053,QN2014091)
【分類號(hào)】：S435.131.4
【正文快照】： 【研究意義】漆酶(EC1.10.3.2)是一類在催化中心含有多個(gè)銅離子的多酚氧化酶,也被稱為多銅氧化酶[1]。在真菌中,漆酶主要參與病菌與寄主間的互作。以玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)漆酶基因Stlac2為出發(fā)點(diǎn),探索其生物學(xué)特性,可為研究其在玉米大斑病菌致病過程中的作用打

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉振盼;王艷輝;董金皋;;玉米大斑病菌完整染色體DNA的制備方法[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2007年06期

2 申s，

本文編號(hào)：724407