本文關(guān)鍵詞：池蝶蚌性別相關(guān)基因Transformer-2α的分子特征及在不同組織和不同發(fā)育階段的表達分析

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【摘要】：池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)是日本獨特品種,產(chǎn)自日本滋賀縣的琵琶湖,其育珠能力及抗病能力均優(yōu)于其他淡水珍珠蚌。本課題以池蝶蚌為實驗對象,取材于4齡健康成熟個體性腺組織,通過SMART RACE PCR及巢式PCR技術(shù)克隆獲得性別相關(guān)基因Transformer-2α(以下簡稱:Hs-Tra2α)的ORF(Open reading frame)框序列及上下游非編碼區(qū)序列,運用生物信息學方法對其結(jié)構(gòu)特征進行了分析。Hs-Tra2α基因cDNA全長1051bp,其中5’UTR(Untranslated Region)長75bp,3’UTR長139bp,包括加尾信號:AATAAA保守區(qū)序列及下游豐富的poly(A)序列;ORF框序列長837bp,編碼由278個氨基酸組成的親水蛋白質(zhì),理論等電點為PI=11.42,分子質(zhì)量約為32715.88Da,經(jīng)在線預測,Hs-Tra2α蛋白細胞亞定位于細胞核。結(jié)構(gòu)域檢測分析表明:Hs-Tra2α蛋白質(zhì)含有SR蛋白(serine/arginine-rich splicing factor,SRSF)家族的高度保守的精氨酸(R)和絲氨酸(A)二肽富集結(jié)構(gòu)域(RS Domain)和RNA識別基元(RNA recognition motif,RRM),也叫RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RNA binding domain,RBD),RRM結(jié)構(gòu)域下游含有Tra2家族特異性Linker連接區(qū)序列。利用predictprotein在線預測其蛋白二級結(jié)構(gòu)顯示Hs-Tra2α蛋白含有大量的無規(guī)則卷曲,在RRM結(jié)構(gòu)域區(qū)域呈現(xiàn)α螺旋和β折疊交替排列;采用SWISS-MODEL在線預測了Hs-Tra2α蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果一致,在RRM結(jié)構(gòu)域可見α螺旋和β折疊交錯排列,可明顯看到β1α1β2β3α2β4結(jié)構(gòu)存在;根據(jù)氨基酸與其他物種的同源性,利用Mega4.0軟中鄰位連接法構(gòu)建了Hs-Tra2α氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹,結(jié)果顯示Hs-Tra2α在進化樹上與太平洋牡蠣Tra2α并為一支,在進化地位上相當保守。采用實時熒光定量技術(shù)對Hs-Tra2α基因在4齡成熟池蝶蚌精巢、卵巢、外套膜、心臟、閉殼肌、肝胰腺、腸、腎、血淋巴、斧足、鰓共11個組織中的mRNA表達進行了檢測分析,結(jié)果顯示:Hs-Tra2α基因普遍地在各個組織中獲得表達,不同組織間存在明顯的差異性,在精巢和卵巢中表達量最高,表達量分別為血淋巴中的53.67倍和23.47倍,表明Hs-Tra2α基因在池蝶蚌不同組織中具有多種生理功能。由于其在性腺中的高表達,我們重點對Hs-Tra2α基因在精巢和卵巢1~5齡不同發(fā)育階段的表達進行了檢測分析,結(jié)果顯示Hs-Tra2α基因在精巢和卵巢的不同發(fā)育階段均得到表達,且存在明顯的差異性,Hs-Tra2在1~5齡精巢和卵巢中的表達量隨著性腺的形成、增殖、生長及成熟呈現(xiàn)規(guī)律性變化,Hs-Tra2α在1齡和2齡階段性腺形成和增殖期有一定量的表達,在2齡和3齡階段性腺生長、成熟期表達量顯著增加,其中在卵巢3齡階段表達量最高,達1齡階段的10.66倍,在精巢2齡和3齡階段的表達量最高,達1齡階段的30倍,在4齡和5齡即池蝶蚌性成熟后的性腺周年性發(fā)育階段有較低表達量,表明Hs-Tra2α基因參與調(diào)控池蝶蚌性腺的雌雄特異性性別分化,對性腺的增殖、發(fā)育及成熟有著至關(guān)重要的作用,在第一次性腺成熟后低表達以維持性腺周年性發(fā)育。
【關(guān)鍵詞】：池蝶蚌 Tra2α 分子特征 生物信息學 熒光定量
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 本實驗所需的器材及試劑7-11
• 第一章 綜述11-21
• 1.1 基因型性別決定機制11-14
• 1.2 環(huán)境型性別決定機制14-16
• 1.3 貝類性別研究進展16-17
• 1.4 Transformer2基因的研究現(xiàn)狀17-20
• 1.5 本研究的內(nèi)容、目的及意義20-21
• 第二章 池蝶蚌Tra2α基因的cDNA全序列克隆及分析21-44
• 2.1 實驗材料與方法22-28
• 2.1.1 實驗材料22
• 2.1.2 池蝶蚌性腺總RNA的提取22
• 2.1.3 RNA的質(zhì)量檢測22-23
• 2.1.4 總RNA的DNase處理23
• 2.1.5 SMART cDNA的合成23-24
• 2.1.6 池蝶蚌Tra2α基因中間片段的獲得24-25
• 2.1.7 RACE-PCR方法克隆池蝶蚌Tra2α基因cDNA全長25-26
• 2.1.8 PCR產(chǎn)物檢測、目的片段的回收、挑克隆與測序26-28
• 2.1.9.池蝶蚌.Tra2α.基因全長序列拼接及開放閱讀框序列分析28
• 2.2 生物信息學分析28-30
• 2.2.1 池蝶蚌Tra2α蛋白氨基酸組成分析28
• 2.2.2 池蝶蚌Tra2α蛋白結(jié)構(gòu)域分析28-29
• 2.2.3 池蝶蚌Tra2α蛋白親水性、信號肽及蛋白分布檢測29
• 2.2.4 池蝶蚌Tra2α蛋白二級結(jié)構(gòu)預測29-30
• 2.2.5 池蝶蚌Tra2α蛋白三級結(jié)構(gòu)預測30
• 2.2.6 池蝶蚌Tra2α氨基酸同源性分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建30
• 2.3 結(jié)果30-42
• 2.3.1 總RNA的提取30-31
• 2.3.2 池蝶蚌.Tra2α.基因部分序列的獲得31
• 2.3.3 池蝶蚌Tra2α基因cDNA全長序列獲得31-32
• 2.3.4 池蝶蚌Tra2α基因全長核酸序列分析32-33
• 2.3.5 池蝶蚌Tra2α蛋白氨基酸組成分析33-35
• 2.3.6 池蝶蚌Tra2α蛋白結(jié)構(gòu)域分析35
• 2.3.7 池蝶蚌Tra2α蛋白親水性及信號肽檢測35-37
• 2.3.8 池蝶蚌Tra2α蛋白二級結(jié)構(gòu)預測37-39
• 2.3.9 池蝶蚌Tra2α蛋白三級結(jié)構(gòu)預測39-40
• 2.3.10 池蝶蚌Tra2α氨基酸同源性分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建40-42
• 2.4 討論42-44
• 第三章 池蝶蚌Tra2α基因在不同組織和不同發(fā)育階段的表達分析44-56
• 3.1 實驗材料與方法45-48
• 3.1.1 實驗材料45
• 3.1.2 總RNA提取45
• 3.1.3 總RNA提取及質(zhì)量檢測45
• 3.1.4 熒光定量cDNA模板的合成45-46
• 3.1.5 熒光定量PCR引物設(shè)計46-47
• 3.1.6 池蝶蚌Tra2α基因在不同組織中的熒光定量檢測47
• 3.1.7 池蝶蚌Tra2α基因在不同齡池蝶蚌性腺組織中的熒光定量檢測47-48
• 3.2 實驗結(jié)果48-52
• 3.2.1 池蝶蚌Tra2α基因的組織差異性表達分析48-50
• 3.2.2 池蝶蚌Tra2α基因在不同年齡池蝶蚌性腺中差異表達分析50-52
• 3.3 討論52-56
• 第四章 結(jié)論與展望56-58
• 4.1 結(jié)論56-57
• 4.2 進一步的工作方向57-58
• 致謝58-59
• 參考文獻59-65
• 攻讀碩士期間的研究成果65

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