本文關(guān)鍵詞：馬鈴薯StNCED1基因的克隆及其功能研究

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【摘要】：植物體內(nèi)ABA合成代謝中的限速酶—9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧合酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)可以調(diào)節(jié)控制植物體內(nèi)脫落酸(ABA)的生物合成。ABA合成代謝C40途徑中的第一個(gè)C15中間體黃質(zhì)醛是由NCED催化新黃質(zhì)產(chǎn)生的,黃質(zhì)醛是ABA合成代謝中的核心產(chǎn)物。本論文以馬鈴薯栽培品種“隴薯3號(hào)”為試驗(yàn)材料,根據(jù)Gen Bank已報(bào)道的StNCED1基因序列設(shè)計(jì)特異引物,用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法獲得了馬鈴薯StNCED1基因的cDNA序列,分別構(gòu)建了StNCED1基因的過表達(dá)載體pBIC-StNCED1和人工microRNA干擾表達(dá)載體pCBP121-amiRNA,通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培品種“隴薯3號(hào)”獲得了轉(zhuǎn)基因植株,對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中StNCED1基因的相對(duì)表達(dá)量和ABA含量進(jìn)行了測(cè)定,為研究StNCED1基因的功能奠定了基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下:1.通過RT-PCR技術(shù)從馬鈴薯栽培品種“隴薯3號(hào)”中獲得了StNCED1基因的cDNA序列,生物信息學(xué)分析表明cDNA全長(zhǎng)1952 bp,編碼區(qū)序列長(zhǎng)1815 bp,與番茄slNCED1基因的同源性達(dá)95%。馬鈴薯StNCED1基因編碼的氨基酸序列分析表明,NCED由603個(gè)氨基酸組成,分子量為67.132 kDa,PI為6.16,氨基酸序列比對(duì)與番茄的同源率最高,可達(dá)98%。2.將StNCED1基因與表達(dá)載體pBIC連接獲得了植物表達(dá)載體pBIC-StNCED1。另外,通過WMD3軟件平臺(tái)設(shè)計(jì)獲得了可以特異性沉默StNCED1基因的ami RNA成熟序列,然后用重疊PCR技術(shù)克隆獲得了amiRNA前體序列。將amiRNA前體序列與表達(dá)載體pCBP121連接,獲得干擾表達(dá)載體pCBP121-amiRNA。3.通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,用含有質(zhì)粒pBIC-StNCED1和干擾表達(dá)載體pCBP121-amiRNA的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培品種“隴薯3號(hào)”獲得了轉(zhuǎn)化植株,經(jīng)過卡那霉素抗性篩選和PCR擴(kuò)增檢測(cè),分別獲得5株(pBIC-StNCED1)和6株(pCBP121-amiRNA)轉(zhuǎn)基因植株。4.誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株獲得了試管薯,對(duì)試管薯中StNCED1基因的相對(duì)表達(dá)量和ABA含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明在轉(zhuǎn)StNCED1基因植株1-5的試管薯中StNCED1基因的相對(duì)表達(dá)量分別上調(diào)2-8倍,ABA含量分別是非轉(zhuǎn)基因植株試管薯的1.10-1.76倍。在干擾表達(dá)StNCED1基因的轉(zhuǎn)基因植株1-6的試管薯中,StNCED1基因的相對(duì)表達(dá)量分別下調(diào)53%-85%,ABA的含量下降了34%-51%�？傊�,通過調(diào)節(jié)馬鈴薯中StNCED1基因的表達(dá)可以調(diào)節(jié)NCED的合成進(jìn)而調(diào)節(jié)ABA的含量,從而說明StNCED1基因在ABA的合成代謝中起重要的調(diào)控作用,為進(jìn)一步闡明StNCED1基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：馬鈴薯 ABA StNCED1基因 amiRNA 遺傳轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S532;Q943.2
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-17
• 1.1 馬鈴薯的休眠10
• 1.2 脫落酸與馬鈴薯休眠10-12
• 1.2.1 脫落酸的生理功能10-11
• 1.2.2 脫落酸的生物合成和分解代謝11
• 1.2.3 脫落酸與馬鈴薯休眠11-12
• 1.2.4 脫落酸合成代謝中的 9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧合酶12
• 1.2.5 對(duì)ABA進(jìn)行分子調(diào)控的研究12
• 1.3 人工miRNA介導(dǎo)的基因沉默12-15
• 1.3.1 基因沉默技術(shù)12-13
• 1.3.2 植物miRNA的合成及其作用方式13-14
• 1.3.3 植物人工miRNA介導(dǎo)的基因沉默14-15
• 1.4 本研究的目的意義和技術(shù)路線15-17
• 1.4.1 本研究的目的和意義15-16
• 1.4.2 技術(shù)路線16-17
• 第二章 馬鈴薯StNCED1基因的克隆及生物信息學(xué)分析17-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料17
• 2.1.1 植物材料17
• 2.1.2 菌株和載體17
• 2.1.3 試劑與工具酶17
• 2.1.4 培養(yǎng)基17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-21
• 2.2.1 馬鈴薯StNCED1基因的克隆17-21
• 2.2.2 馬鈴薯StNCED1基因和蛋白的同源性分析21
• 2.3 結(jié)果與分析21-26
• 2.3.1 馬鈴薯StNCED1基因的克隆21-23
• 2.3.2 生物信息學(xué)分析23-26
• 2.4 討論26-27
• 第三章 植物表達(dá)載體與人工microRNA干擾載體的構(gòu)建27-38
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料27
• 3.1.1 質(zhì)粒和菌株27
• 3.1.2 試劑與工具酶27
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法27-33
• 3.2.1 StNCED1基因過表達(dá)載體的構(gòu)建27-28
• 3.2.2 人工microRNA干擾載體的構(gòu)建28-33
• 3.3 結(jié)果與分析33-36
• 3.3.1 pBIC- StNCED1過表達(dá)載體的PCR擴(kuò)增檢測(cè)和酶切鑒定33-34
• 3.3.2 人工microRNA干擾載體的構(gòu)建34-36
• 3.4 討論36-38
• 第四章 StNCED1基因轉(zhuǎn)化馬鈴薯及脫落酸含量的測(cè)定38-48
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料38
• 4.1.1 植物材料與菌株38
• 4.1.2 酶與試劑38
• 4.1.3 培養(yǎng)基38
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法38-42
• 4.2.1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化馬鈴薯38-39
• 4.2.2 轉(zhuǎn)化植株的獲得與檢測(cè)39-40
• 4.2.3 轉(zhuǎn)基因試管薯的qRT-PCR表達(dá)分析40-41
• 4.2.4 轉(zhuǎn)基因試管薯的脫落酸測(cè)定41-42
• 4.3 結(jié)果與分析42-46
• 4.3.1 轉(zhuǎn)化植株的獲得42
• 4.3.2 轉(zhuǎn)化植株的的PCR檢測(cè)42-43
• 4.3.3 qRT-PCR分析StNCED1基因的相對(duì)表達(dá)量43-44
• 4.3.4 脫落酸的含量的測(cè)定與分析44-46
• 4.4 討論46-48
• 第五章 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-56
• 致謝56-57
• 作者介紹57-58
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介58-59

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：706088