本文關(guān)鍵詞：蛹蟲草和蟬花組氨酸激酵基因的表達(dá)以及蛹蟲草組氨酸激酶蛋白檢測

  更多相關(guān)文章： 蛹蟲草 蟬花 組氨酸激酶 殺真菌劑 實時熒光定量PCR Western blotting

【摘要】：組氨酸激酶是雙組份系統(tǒng)的重要部分,而雙組份系統(tǒng)是真菌感受外界刺激的重要機(jī)制,它使真菌能適應(yīng)和應(yīng)答環(huán)境的改變。蟬花和蛹蟲草是傳統(tǒng)的藥食兩用真菌,通過對其組氨酸激酶基因的研究,在理論上比較同為它們的組氨酸激酶基因的表達(dá)調(diào)控差異。根據(jù)已知的蛹蟲草組氨酸激酶基因(CmHK)的序列來設(shè)計引物,對蟬花組氨酸激酶基因IcHK進(jìn)行克隆,克隆獲得的序列經(jīng)過測序、比對,最終獲得了IcHK基因的開放閱讀框(ORF)序列,全長為2811bp。對序列進(jìn)行分析表明,IcHK基因可編碼963個氨基酸殘基,它的翻譯產(chǎn)物IcHK有4個HAMP功能域、1個HisKA功能域、1個HATPase_c功能域和1個REC功能域。長期以來,對組氨酸激酶的研究主要聚焦在它對外界信號的表達(dá)調(diào)控上,且近年來有關(guān)殺真菌劑表達(dá)調(diào)控的研究頗多。采用實時熒光定量PCR方法研究了三種殺真菌劑(咯菌腈、異菌脲和克菌丹)對蛹蟲草組氨酸激酶CmHK和蟬花組氨酶激酶IcHK表達(dá)的影響。結(jié)果表明,CmHK基因和IcHK基因?qū)@三種殺菌劑的敏感性均有所不同:這三種殺菌劑不能導(dǎo)致CmHK基因的相對轉(zhuǎn)錄量明顯增加,因此CmHK基因的表達(dá)對這三種殺菌劑的影響不敏感;而它們都可導(dǎo)致IcHK基因的相對轉(zhuǎn)錄量的增加,說明IcHK基因的表達(dá)對這三種殺菌劑的影響都敏感,尤其對咯菌腈和克菌丹更為敏感。針對已獲得的蛹蟲草組氨酸激酶基因,設(shè)計兩種方法來制備抗體,一種方法是通過原核表達(dá)CmHK基因的部分序列獲得融合表達(dá)蛋白,并以此作為抗原制備抗體。依據(jù)CmHK基因ORF序列及其功能域分析,將其分為兩段(CmHK1和CmHK2)分別設(shè)計引物,將PCR獲得的CmHK1和CmHK2兩個部分序列分別連接表達(dá)載體pET-41a(+),最終轉(zhuǎn)化到BL21(Escherichia coli)受體細(xì)胞,以構(gòu)建CmHK1和CmHK2的原核表達(dá)系統(tǒng)。利用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá),并使用ProteinIsoTM Ni-NTA Resin純化表達(dá)蛋白。純化的融合蛋白CmHK1和CmHK2作為抗原免疫家兔后獲得了兩種抗體anti-CmHK1和anti-CmHK2。另一種方法是化學(xué)合成CmHK抗原決定簇短肽,偶聯(lián)載體蛋白后作為抗原制備抗體�；瘜W(xué)合成三條短肽HK3、HK4和HK5后,分別與BSA偶聯(lián)作為抗原制備了三種抗體anti-HK3、anti-HK4和anti-HK5。將這兩種方法獲得的抗體通過Western blotting方法檢測CmHK在蛹蟲草中的存在形式。Western blotting分析發(fā)現(xiàn)只有anti-CmHK2沒有出現(xiàn)特異性條帶,其他抗體均有特異性條帶出現(xiàn)。在蛹蟲草菌絲體中均可檢測到兩條特異的蛋白雜交帶,分別為85 kDa和45 kDa,表明組氨酸激酶CmHK的可能存在形式有85kD和45kD兩種。
【關(guān)鍵詞】：蛹蟲草 蟬花 組氨酸激酶 殺真菌劑 實時熒光定量PCR Western blotting
【學(xué)位授予單位】：江西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 1 引言10-16
• 1.1 蛹蟲草10
• 1.2 蟬花10-11
• 1.3 雙組份系統(tǒng)11-14
• 1.3.1 雙組份系統(tǒng)概述11
• 1.3.2 雙組份系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)11-12
• 1.3.3 雙組份系統(tǒng)的反應(yīng)機(jī)制12-13
• 1.3.4 雙組份系統(tǒng)的分類13-14
• 1.4 本研究的目的與意義14-16
• 2 蟬花組氨酸激酶（IcHK）基因的克隆和序列分析16-28
• 2.1 實驗材料與試劑16-18
• 2.1.1 實驗菌株16
• 2.1.2 試劑16-17
• 2.1.3 主要儀器17-18
• 2.1.4 培養(yǎng)基的配制18
• 2.1.5 溶液的配制18
• 2.2 引物設(shè)計18-19
• 2.3 實驗方法19-21
• 2.3.1 蟬花菌絲體的培養(yǎng)19
• 2.3.2 蟬花菌絲體總RNA的提取19
• 2.3.3 DNA去除反應(yīng)19-20
• 2.3.4 RNA反轉(zhuǎn)錄20-21
• 2.3.5 IcHK基因ORF的PCR分析21
• 2.3.6 基因測序及序列分析21
• 2.4 實驗結(jié)果及分析21-27
• 2.4.1 蟬花總RNA提取21-22
• 2.4.2 消化后的蟬花總RNA22
• 2.4.3 IcHK基因ORF序列PCR22-23
• 2.4.4 基因測序及序列分析23-27
• 2.5 討論與小結(jié)27-28
• 3 蛹蟲草和蟬花組氨酸激酶基因受殺菌劑影響的表達(dá)28-36
• 3.1 實驗材料28-29
• 3.1.1 實驗菌株28
• 3.1.2 試劑28
• 3.1.3 主要儀器28-29
• 3.1.4 培養(yǎng)基的配置29
• 3.1.5 溶液的配置29
• 3.2 引物設(shè)計29-30
• 3.3 實驗方法30-32
• 3.3.1 蛹蟲草和蟬花菌絲體的培養(yǎng)30
• 3.3.2 蛹蟲草菌絲體和蟬花菌絲體的殺菌劑培養(yǎng)和取樣30
• 3.3.3 蟬花和蛹蟲草菌絲體RNA的提取30
• 3.3.4 基因組DNA的去除和RNA反轉(zhuǎn)錄30-31
• 3.3.5 Real-Time PCR反應(yīng)31
• 3.3.6 Real-Time RCR反應(yīng)數(shù)據(jù)處理31-32
• 3.4 實驗結(jié)果及分析32-35
• 3.4.1 蛹蟲草和蟬花總RNA的提取32
• 3.4.2 咯菌腈對組氨酸激酶表達(dá)水平的real-time PCR檢測分析32-33
• 3.4.3 異菌脲對組氨酸激酶表達(dá)水平的real-time PCR檢測分析33-34
• 3.4.4 克菌丹對組氨酸激酶表達(dá)水平的real-time PCR檢測34-35
• 3.5 討論與小結(jié)35-36
• 4 蛹蟲草組氨酸激酶CmHK抗體的制備及其western blotting初步分析36-58
• 4.1 實驗材料36-39
• 4.1.1 實驗菌株36
• 4.1.2 試劑36-37
• 4.1.3 主要儀器37
• 4.1.4 培養(yǎng)基的配制37
• 4.1.5 溶液的配制37-39
• 4.2 制備組氨酸激酶CmHK抗體所需抗原蛋白的選擇39
• 4.2.1 CmHK原核表達(dá)CmHK基因部分序列39
• 4.2.2 CmHK中部分序列的化學(xué)合成39
• 4.3 實驗方法39-49
• 4.3.1 蛹蟲草菌絲體的培養(yǎng)39-40
• 4.3.2 蟬花菌絲體總RNA的提取40
• 4.3.3 DNA去除反應(yīng)40
• 4.3.4 RNA反轉(zhuǎn)錄40
• 4.3.5 CmHK基因ORF部分序列PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測40-41
• 4.3.6 利用E.Z.N.A. ~(TM)Gel Extraction Kit膠回收PCR產(chǎn)物41
• 4.3.7 質(zhì)粒與PCR片段的雙酶切41-42
• 4.3.8 利用E.Z.N.A. ~(TM)Cycle-Pure Kit回收PCR產(chǎn)物42
• 4.3.9 雙酶切質(zhì)粒和雙酶切片段的連接42-43
• 4.3.10 轉(zhuǎn)化43
• 4.3.11 PCR方法鑒定正確表達(dá)方向的陽性重組子43
• 4.3.12 質(zhì)粒抽提43-44
• 4.3.13 酶切分析陽性重組質(zhì)粒44-45
• 4.3.14 測序45
• 4.3.15 CmHK基因ORF部分的表達(dá)45
• 4.3.16 CmHK基因ORF兩個部分的表達(dá)蛋白的SDS-PAGE45-47
• 4.3.17 CmHK基因ORF兩個部分的表達(dá)蛋白的純化47
• 4.3.18 抗體的制備47
• 4.3.19 抗體的純化47-48
• 4.3.20 ELISA檢測多克隆抗體效價48
• 4.3.21 Western Blotting48-49
• 4.4 實驗結(jié)果及分析49-56
• 4.4.1 蛹蟲草總RNA49
• 4.4.2 消化后的蛹蟲草總RNA49-50
• 4.4.3 CmHK基因ORF部分序列PCR及產(chǎn)物純化50
• 4.4.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與驗證50-51
• 4.4.5 基因測序結(jié)果及序列分析51-53
• 4.4.6 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE結(jié)果53
• 4.4.7 純化蛋白 SDS-PAGE 結(jié)果53-54
• 4.4.8 ELISA結(jié)果54-55
• 4.4.9 Western Blotting結(jié)果55-56
• 4.5 討論與小結(jié)56-58
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 致謝66-67
• 在讀期間公開發(fā)表論文（著）及科研情況67

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本文編號：700397