本文關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒的分離、鑒定及全基因序列分析

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【摘要】：豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一種急性傳染病,可引起豬只急性腹瀉并迅速脫水、死亡,對哺乳仔豬危害最大。近年來,PED在世界各地頻繁爆發(fā)。眾多研究表明,PEDV變異是導(dǎo)致疫情加劇的主要原因。因此對變異毒株開展組織培養(yǎng)特性、病理學(xué)特性、分子生物學(xué)特性的系統(tǒng)研究具有重要意義。本研究以采自四川峨眉某豬場疑似PEDV感染仔豬的小腸及內(nèi)容物作病料,經(jīng)RT-PCR檢測,選擇PEDV陽性病料按常規(guī)方法處理后接種Vero細胞進行病毒分離,并在細胞維持液中按5 μg/mL量加入胰酶,盲傳至出現(xiàn)典型細胞病變。結(jié)果在第5代開始出現(xiàn)細胞病變(CPE),傳至第25代可在接毒后20 h穩(wěn)定出現(xiàn)典型CPE,表現(xiàn)為細胞變圓和變亮、顆粒物變多、細胞融合、細胞脫落、死亡并形成拉網(wǎng)狀,對分離毒進行挑斑純化。經(jīng)RT-PCR檢測和S基因測序證實本研究成功分離了PEDV毒株,將其命名為EM-P株。經(jīng)測定病毒的TCID50為1×10-6·5/mL將分離株EM-P口服接種1周齡哺乳仔豬,成功建立PED病理模型。相應(yīng)組織器官病理組織學(xué)觀察顯示,PEDV EM-P株所致感染呈持續(xù)性、多臟器性,且主要損傷腸道、腸系膜淋巴結(jié)、肺、脾。剖檢病理變化表現(xiàn)為腸壁變薄、充血,腸上皮細胞脫落；腸系膜淋巴充血,淋巴細胞減少、細胞空泡變性：肺邊緣貧血,局部淤血、水腫,肺泡融合：脾邊緣變薄呈半透明狀,白髓萎縮等。利用PEDV N基因和內(nèi)參基因GAPDH基因建立了qRT-PCR方法,并用該方法對相應(yīng)組織進行病毒載量檢測,結(jié)果在腸、腸系膜淋巴結(jié)、肺、脾中病毒載量最高,而且感染時間早、持續(xù)時間長。以上研究結(jié)果表明感染仔豬病理損傷程度與病毒載量呈正相關(guān)。參照Genebank已公布的PEDV CV777株全基因序列,設(shè)計18對引物,對EM-P株進行全基因分段克隆。EM-P株接種Vero細胞至75%以上細胞出現(xiàn)CPE后,提取總RNA為模板,經(jīng)RT-PCR擴增得到18個片段,經(jīng)克隆、測序及拼接,獲得EM-P株全基因組(cDNA)序列。基因組全長28029 bp,經(jīng)與已報道6個代表毒株進行比對分析,結(jié)果顯示EM-P株具有典型的PEDV基因組特征,與參考毒株同源性在97.3%-98.2%。以PEDV CV777株為參考對各基因序列進行分析,結(jié)果顯示EM-P株S1基因、ORF1基因等出現(xiàn)明顯變異,推測其可能導(dǎo)致毒株免疫原性和病毒復(fù)制能力等生物特性改變。而EM-P株ORF3基因具有完整的開放閱讀框,符合強毒株特征。以PEDV CV777株等18個毒株為參考,重點對EM-P株S基因序列進行系統(tǒng)分析并構(gòu)建遺傳進化樹,顯示EM-P株位于G1-1亞群,但又獨立為一個分支,說明EM-P株可歸為新流行毒株；EM-P株與CV777株、加拿大、日本、韓國等其它多數(shù)國家的流行毒株及2010年以前的中國毒株處于同一亞群,提示該毒株既可能由國外傳入也可能是原有流行毒株變異而成。
【關(guān)鍵詞】：豬流行性腹瀉病毒 分離 鑒定 全基因測序
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.651
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 縮略詞8-11
• 第一章 文獻綜述11-18
• 1 PEDV病原學(xué)特性11
• 2 PEDV基因組結(jié)構(gòu)特征11-13
• 2.1 5'-UTR與3'-UTR11-12
• 2.2 結(jié)構(gòu)基因12
• 2.3 非結(jié)構(gòu)基因12-13
• 2.4 基因分型和流行特點13
• 3 PEDV細胞培養(yǎng)特性13-15
• 4 PEDV致病性15-17
• 4.1 流行病學(xué)15-16
• 4.2 臨床癥狀16
• 4.3 解剖癥狀16
• 4.4 發(fā)病機理16-17
• 5 PEDV檢測方法17
• 6 研究目的和意義17-18
• 第二章 PEDV EM-P株的分離與鑒定18-37
• 1 實驗材料18-20
• 1.1 病料收集18
• 1.2 主要試劑及配制18-19
• 1.3 儀器設(shè)備19
• 1.4 引物合成19
• 1.5 細胞及實驗動物19-20
• 2 實驗方法20-23
• 2.1 病料處理及RT-PCR檢測20
• 2.2 PEDV的分離與培養(yǎng)20-21
• 2.3 RT-PCR檢測及S基因測序21
• 2.4 病毒TCID_(50)的測定21
• 2.5 分離株人工感染哺乳仔豬試驗21-23
• 3 結(jié)果23-32
• 3.1 RT-PCR檢測結(jié)果23-24
• 3.2 PEDV的分離與培養(yǎng)24-25
• 3.3 RT-PCR檢測及S基因測序25-26
• 3.4 病毒TCID_(50)測定26
• 3.5 分離株人工感染哺乳仔豬試驗26-32
• 4 討論32-36
• 4.1 分離株的Vero細胞培養(yǎng)特性33
• 4.2 分離株的病理學(xué)特性33-36
• 5 小結(jié)36-37
• 第三章 PEDV EM-P株全基因測序37-57
• 1 試驗材料37-39
• 1.1 毒株、細胞及主要試劑37
• 1.2 主要儀器設(shè)備37
• 1.3 分子生物學(xué)分析軟件37
• 1.4 引物設(shè)計與合成37-39
• 2 試驗方法39-43
• 2.1 PEDV的增殖39
• 2.2 RNA提取39
• 2.3 cDNA合成39-40
• 2.4 擴增與克隆40-41
• 2.5 目的片段純化41
• 2.6 重組質(zhì)粒構(gòu)建41-42
• 2.7 全基因組序列分析42-43
• 3 結(jié)果43-52
• 3.1 全基因分段擴增及克隆43-44
• 3.2 全基因組序列拼接44-45
• 3.3 全基因組分析45-46
• 3.4 各序列片段遺傳與變異情況46-51
• 3.5 針對S基因的進化樹構(gòu)建51-52
• 4 討論52-55
• 4.1 全基因序列分析52
• 4.2 各序列片段遺傳與變異情況52-55
• 4.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析55
• 5 小結(jié)55-57
• 全文總結(jié)57-58
• 參考文獻58-64
• 致謝64-65
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文65

【參考文獻】

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本文編號：696504