發(fā)布時間：2017-08-18 00:17

  本文關(guān)鍵詞：大黃魚清道夫受體家族基因鑒定及表達分析

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【摘要】：清道夫受體(Scavenger receptors,SRs)是由一類結(jié)構(gòu)各異功能多樣的跨膜表面糖蛋白分子組成的蛋白質(zhì)家族,本文主要基于大黃魚(Larimichthys crocea)基因組數(shù)據(jù)庫,對大黃魚清道夫受體家族成員進行密碼子偏好性、系統(tǒng)演化等生物信息學(xué)分析;對克隆得到全家族成員的完整編碼區(qū)的重要結(jié)構(gòu)域進行解析;再利用致病性溶藻弧菌進行腹腔刺激感染,分析不同家族成員的mRNA表達模式,選取表達明顯上調(diào)的A和F家族基因成員進行重點分析和后續(xù)研究,具體包括以下幾方面:1.針對大黃魚清道夫受體4個家族8個成員的密碼子偏好性進行分析,全部成員均包含20種不同的氨基酸。通過Codon W等偏好性軟件計算包括密碼子適應(yīng)指數(shù)在內(nèi)的11個偏好性指數(shù),比較綜合地反應(yīng)了清道夫受體家族在進化中的密碼子偏好情況,進一步與人清道夫受體家族成員進行對比,結(jié)果并未顯示大黃魚清道夫受體家族有強的密碼子偏好使用情況;基于RSCU值繪制59個同義密碼子的偏好熱圖,也未顯示出該家族基因密碼子有強的偏好程度,對應(yīng)性分析結(jié)果表明所有四種核苷酸結(jié)尾的密碼子在Axis1-Axis2的四個象限都有分布,其中第一和第四象限分布較少,第二和第三象限分布較為集中,但未發(fā)現(xiàn)較強的線性關(guān)系,綜合上述結(jié)果認為在大黃魚清道夫受體家族基因密碼子中沒有偏好使用情況。2.在了解大黃魚清道夫受體家族基因密碼子偏好性的基礎(chǔ)上,進一步闡釋了整個清道夫家族基因的系統(tǒng)演化規(guī)律。根據(jù)已獲得的清道夫受體家族基因序列,經(jīng)BLASTn同源性分析顯示,大黃魚清道夫4個家族8個成員均可以找到與之同源的不同物種的相應(yīng)分子序列,所有序列均證實與全基因組測序后的注釋一致,基因名稱也并未出現(xiàn)差異。利用進化樹分析軟件MEGA v4.0構(gòu)建無根系統(tǒng)發(fā)育樹,4個家族8個基因分別與不同物種的同一家族基因相互成簇,各聚成支,例如A和F家族的成員,D家族單獨成支。每一個家族隨物種進化程度不同而相互分開,說明各受體基因家族存在明顯差別,具有相對獨立的保守結(jié)構(gòu)域,進化的變異程度不同。從基因線性結(jié)構(gòu)來看,8個成員分布在8個不同的Scaffold位置,意味著這些基因或許處于不同的染色體,所有清道夫家族成員基因的方向不完全一致,可能與基因的轉(zhuǎn)錄效率和基因表達強度,及與之相關(guān)的調(diào)控過程有關(guān)。根據(jù)大黃魚全基因組數(shù)據(jù)庫,分析清道夫受體外顯子與內(nèi)含子結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示各成員所擁有不同數(shù)目和不同長度的外顯子和內(nèi)含子,可能與基因在轉(zhuǎn)錄進化過程有關(guān)。進一步預(yù)測7個成員基因(除LycSCARB1以外)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu),比較其關(guān)鍵功能域的空間位置,上述研究結(jié)果對解析清道夫受體的基因起源、分型聚類、結(jié)構(gòu)組成以及染色體上的基因線性組成,為后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。3.對大黃魚清道夫受體基因的表達調(diào)控模式進行研究,來進一步掌握清道夫受體家族的免疫功能。組織特異性表達研究顯示,大黃魚所有清道夫受體基因在肝臟、脾臟、腦、心臟、頭腎、肌肉、腮和腸等組織中的都有表達,其中肝臟、脾臟、腦、頭腎、肌肉5種組織中表達量較高,心臟、腮和腸等3種組織中表達量較低。a家族基因在脾臟中的表達量最高,而其他家族基因都在肝臟中有最高的表達水平。所有基因都對溶藻弧菌感染后表現(xiàn)出上調(diào)表達,但最高表達量出現(xiàn)的時間略有差別,基本都集中在24~48小時之間,f家族中的lycsrec2從感染后6h就開始表現(xiàn)出高的表達量。另一方面,細胞質(zhì)膜、細胞外部和溶酶體是清道夫受體的主要亞細胞定位區(qū),即a家族和f家族基因主要集中在細胞質(zhì)膜上,b家族的lyccd163主要集中在細胞外部,lycscarb1和d家族主要集中溶酶體上。結(jié)合上述實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),a家族和f家族對藻弧菌感染有較強的應(yīng)激反應(yīng),但具體的調(diào)控機制還需要進一步研究。4.對其中具有免疫功能的a家族成員進行深入研究,通過基因同源克隆得到lycscara3、lycscara5和lycmarco三個基因開放閱讀框,經(jīng)序列比對和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)所得到的三個基因與已知的scara3,scara5和marco基因高度同源。lycscara3和lycscara5在進化樹中分別與其他硬骨魚類的相關(guān)基因聚成一支,而lycmarco卻與爬行動物聚成一支,說明三個基因在進化上存在一定的差異。clustalw分析顯示lycscara3與其他物種的scara3的同源性為59~71%,lycscara5為55~72%,而lycmarco只有38%左右。在lycscara5羧基末端發(fā)現(xiàn)6個半胱氨酸富集區(qū)(c-482,c-495,c-526,c-536,c-546和c-556,在lycmarco羧基末端同樣發(fā)現(xiàn)6個半胱氨酸富集區(qū)(c-333,c-346,c-374,c-384,c-394和c-404)。在lycscara3和lycscara5中還發(fā)現(xiàn)了兩處與traf2結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和涉及內(nèi)在折疊的酪氨酸保守區(qū)。利用genemaperv2.5對三個基因的dna序列進行分析,lycscara3和lycmarco的外顯子都為13個,內(nèi)含子12個,lycscara5則短一些只有12個外顯子和11個內(nèi)含子。對a家族成員在8種組織中的差異性表達分析表明,lycscara3、lycscara5和lycmarco三個基因均在脾臟出現(xiàn)最高表達,在肌肉,腦和肝臟中都有較高表達。進一步通過溶藻弧菌感染,檢測脾臟中三個基因的時序變化情況,結(jié)果顯示溶藻弧菌可上調(diào)三個基因的表達,但最高表達量出現(xiàn)的時間略有差別,相對于lycscara3,由于srcr結(jié)構(gòu)域的存在,lycscara5和lycmarco基因?qū)Ω腥据^為敏感且反應(yīng)較為迅速。通過原核表達得到LycMARCO基因蛋白的初級產(chǎn)物,可以為今后的蛋白功能研究以及信號通路研究提供參考。5.同源法克隆得到LycSREC1和LycSREC2兩個基因開放閱讀框,經(jīng)序列比對和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)所得到的三個基因與已知的SREC I和SREC II基因高度同源。LycSREC1分子包含有8個EGF或EGF-like結(jié)構(gòu)域,而LycSREC2分子包含有7個EGF或EGF-like結(jié)構(gòu)域,從氨基酸比較分析來看,LycSREC1和LycSREC2基因與其他物種的相應(yīng)分子存在一些保守的區(qū)域,尤其是在一些重要的結(jié)構(gòu)域上,如EGF結(jié)構(gòu)域、TRAF2因子和酪氨酸活化區(qū)等特殊因子或結(jié)構(gòu)域等。針對LycSREC1和LycSREC2兩個基因中出現(xiàn)的EGF結(jié)構(gòu)域進行物種差異性比對發(fā)現(xiàn),EGF結(jié)構(gòu)域在這些物種中相對保守,僅有幾個位點的氨基酸存在變異,說明EGF結(jié)構(gòu)域在長期進化中相對保守的,并未出現(xiàn)大量的變異位點,這可能與其所行使的功能有關(guān)。LycSREC1的DNA序列共長7603 bp,擁有12個外顯子和11個內(nèi)含子,而LycSREC2的DNA序列僅長4883bp,僅有4個外顯子和3個內(nèi)含子,都短于人和鼠等哺乳類動物。將大黃魚清道夫受體F家族成員及與其關(guān)聯(lián)基因和人相關(guān)基因進行比較發(fā)現(xiàn)有部分基因發(fā)生了偏移,其中有5個基因在10個不同物種中也同樣出現(xiàn)了基因偏移現(xiàn)象,這將有助于理解基因的漂變和物種適應(yīng)性變化。進一步通過溶藻弧菌感染,檢測肝臟中LycSREC1和LycSREC2基因mRNA的時序表達變化發(fā)現(xiàn)兩個基因都對溶藻弧菌刺激表現(xiàn)出上調(diào)表達,但最高表達量出現(xiàn)的時間略有差別,LycSREC2較LycSREC1早一點,在感染后6小時就達到峰值,表達值是對照組的40倍左右,而LycSREC1在感染后12小時才達到峰值,僅是對照組的15倍左右。上述結(jié)果充分說明,大黃魚清道夫受體家族基因成員參與了魚類的天然免疫,通過密碼子偏好性、系統(tǒng)演化等闡釋了清道夫受體在免疫過程中的基本分子機制,對A和F家族的系統(tǒng)研究將有助于理解清道夫受體在石首魚類天然免疫受體家族中的作用,為今后開展魚病防治和疫苗研究提供借鑒,但仍有一些侵染機制目前尚無從知曉,有待后續(xù)研究。
【關(guān)鍵詞】：大黃魚 溶藻弧菌 清道夫受體家族 免疫調(diào)控 表達
【學(xué)位授予單位】：浙江海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4;Q78
【目錄】：

• 摘要8-11
• ABSTRACT11-18
• 第一章 文獻綜述18-27
• 1.1 大黃魚常見病原微生物18-19
• 1.2 魚類主要免疫器官與免疫細胞19
• 1.3 先天性免疫模式識別受體19-23
• 1.3.1 可溶性橋接型模式識別受體20-21
• 1.3.2 內(nèi)吞型模式識別受體21-22
• 1.3.3 信號傳導(dǎo)型模式識別受體22-23
• 1.3.4 以巨噬細胞為主的先天免疫系統(tǒng)23
• 1.4 清道夫受體家族的發(fā)展歷程及分類23-24
• 1.4.1 清道夫受體家族的發(fā)現(xiàn)23-24
• 1.4.2 家族成員分類24
• 1.5 清道夫受體家族的免疫特性24-25
• 1.6 本文所做工作及研究內(nèi)容25-27
• 第二章 大黃魚清道夫受體家族密碼子偏好性分析27-39
• 2.1 材料與方法27-30
• 2.1.1 基因組來源27
• 2.1.2 相關(guān)軟件及計算公式27-30
• 2.2 結(jié)果與討論30-37
• 2.2.1 常規(guī)參數(shù)30-31
• 2.2.2 偏好性指數(shù)31-35
• 2.2.3 基于RSCU值的偏好性分析35-36
• 2.2.4 對應(yīng)性分析36-37
• 2.3 本章小結(jié)37-39
• 第三章 大黃魚清道夫受體家族系統(tǒng)演化分析39-52
• 3.1 材料與方法39-44
• 3.1.1 主要儀器39-40
• 3.1.2 實驗材料預(yù)處理40
• 3.1.3 總RNA抽提與cDNA第一鏈合成40-41
• 3.1.4 大黃魚清道夫受體家族基因擴增與純化41-43
• 3.1.5 T-A克隆與測序43-44
• 3.1.6 序列分析44
• 3.2 結(jié)果與討論44-51
• 3.2.1 重測序驗證44
• 3.2.2 同源性分析44-46
• 3.2.3 系統(tǒng)進化發(fā)育分析46-48
• 3.2.4 基因線性結(jié)構(gòu)分析48-49
• 3.2.5 外顯子與內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析49-50
• 3.2.6 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析50-51
• 3.3 本章小結(jié)51-52
• 第四章 大黃魚清道夫受體家族的表達調(diào)控分析52-61
• 4.1 材料與方法52-54
• 4.1.1 實驗動物處理與樣品收集52
• 4.1.2 總RNA抽提與cDNA第一鏈合成52
• 4.1.3 組織特異性分布表達52-53
• 4.1.4 受溶藻弧菌感染后的基因時空表達53
• 4.1.5 數(shù)據(jù)分析53-54
• 4.1.6 亞細胞定位預(yù)測54
• 4.2 結(jié)果與討論54-60
• 4.2.1 8 種組織的總RNA特征54
• 4.2.2 清道夫受體的組織特異性分布54-56
• 4.2.3 受溶藻弧菌感染后清道夫受體的時空表達56-57
• 4.2.4 亞細胞結(jié)構(gòu)定位57-60
• 4.3 本章小結(jié)60-61
• 第五章 大黃魚清道夫受體A家族鑒定和表達分析61-79
• 5.1 材料與方法61-65
• 5.1.1 樣品收集與總RNA抽提61
• 5.1.2 cDNA第一鏈合成與基因克隆61
• 5.1.3 序列分析61-62
• 5.1.4 受溶藻弧菌感染后清道夫受體A家族基因的表達模式62
• 5.1.5 清道夫A家族MARCO基因胞內(nèi)段克隆62-63
• 5.1.6 雙酶切與原核表達重組載體構(gòu)建63-64
• 5.1.7 誘導(dǎo)表達與SDS-PAGE電泳分析64-65
• 5.2 結(jié)果與討論65-77
• 5.2.1 大黃魚清道夫受體A家族基因序列分析65-68
• 5.2.2 氨基酸比對分析68-71
• 5.2.3 主要結(jié)構(gòu)域分析71
• 5.2.4 系統(tǒng)進化分析71-72
• 5.2.5 基因結(jié)構(gòu)分析72-74
• 5.2.6 mRNA表達分析74
• 5.2.7 原核表達分析74-76
• 5.2.8 討論76-77
• 5.3 本章小結(jié)77-79
• 第六章 大黃魚清道夫受體F家族的鑒定和表達分析79-94
• 6.1 材料與方法79-80
• 6.1.1 樣品收集與總RNA抽提79
• 6.1.2 cDNA第一鏈合成與基因克隆79
• 6.1.3 序列分析79-80
• 6.1.4 受溶藻弧菌感染后清道夫受體F家族基因的表達模式80
• 6.2 結(jié)果與討論80-92
• 6.2.1 大黃魚清道夫受體F家族基因序列分析80-82
• 6.2.2 氨基酸比對分析82-84
• 6.2.3 主要結(jié)構(gòu)域分析84-86
• 6.2.4 系統(tǒng)進化分析86-87
• 6.2.5 基因結(jié)構(gòu)分析87-88
• 6.2.6 基因線性結(jié)構(gòu)分析88-90
• 6.2.7 mRNA表達分析90-91
• 6.2.8 討論91-92
• 6.3 本章小結(jié)92-94
• 參考文獻94-105
• 致謝105-106
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果106-107

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