本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)ZmHAK1基因擬南芥吸收轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子的研究及RNA干擾載體的構(gòu)建

  更多相關(guān)文章： 轉(zhuǎn)基因擬南芥 ZmHAK1基因 表達(dá)分析 鉀效率 RNA干擾載體

【摘要】：鉀是農(nóng)作物生產(chǎn)、豐收必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素,但我國(guó)耕地土壤普遍缺鉀,鉀素缺乏已成為作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的限制因子。植物在逆境脅迫下生長(zhǎng),有許多非生物脅迫應(yīng)答基因參與調(diào)控,使植物自身適應(yīng)環(huán)境。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,許多低鉀脅迫應(yīng)答基因被發(fā)現(xiàn)。研究這些耐低鉀基因的功能,培育出新的耐低鉀農(nóng)作物品種,將其應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,是高效利用土壤中鉀素營(yíng)養(yǎng)的有效途徑。低鉀脅迫下,植物主要利用高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體吸收介質(zhì)中的K+,因此研究高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體吸收轉(zhuǎn)運(yùn)鉀的能力具有實(shí)踐意義。為此,本文進(jìn)行了轉(zhuǎn)Zm HAK1基因擬南芥的研究及RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建,旨在探索Zm HAK1基因?qū)χ参镂辙D(zhuǎn)運(yùn)鉀離子能力的影響。本試驗(yàn)利用蘸花侵染法將已構(gòu)建的p Cambia1301-Zm HAK1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到高親和鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體基因缺失的擬南芥突變體中。利用濃度為0.1%的Basta對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選,對(duì)存活的陽(yáng)性植株進(jìn)行Bar基因和Zm HAK1基因的PCR檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果表明成功獲得了轉(zhuǎn)Zm HAK1基因的T1代擬南芥植株。繼續(xù)繁殖、篩選、鑒定獲得能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥T5代。以T5代植株為材料進(jìn)行q RT-PCR試驗(yàn)。結(jié)果表明,Zm HAK1基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株各組織均有表達(dá),無(wú)表達(dá)特異性,但在根、莖中表達(dá)量較高。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥在持續(xù)低鉀脅迫處理下根、莖、花中Zm HAK1基因表達(dá)水平進(jìn)行分析,結(jié)果表明Zm HAK1基因的表達(dá)受低鉀脅迫誘導(dǎo),不同組織中目的基因表達(dá)量不同程度上調(diào),且維持較高表達(dá)水平,其中根部目的基因表達(dá)量上調(diào)最高,72h時(shí)的表達(dá)量達(dá)到處理前的19倍。鉀吸收動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥具有較大的Imax值和較小的Km、Cmin、β值,并且在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到吸收平衡,說(shuō)明過(guò)表達(dá)擬南芥植株有較強(qiáng)的吸鉀能力。鉀含量相關(guān)指標(biāo)分析結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)擬南芥有較大的AKA和KUI值,說(shuō)明過(guò)表達(dá)植株不僅有較強(qiáng)的吸鉀能力,而且有較好利用鉀的能力。主要逆境生理指標(biāo)分析測(cè)定結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)擬南芥植株在低鉀脅迫環(huán)境中,細(xì)胞受傷害程度明顯低于突變體對(duì)照,進(jìn)一步說(shuō)明過(guò)表達(dá)擬南芥植株耐低鉀脅迫能力較突變體對(duì)照有所提高,能夠?qū)Φ外浢{迫產(chǎn)生響應(yīng)。低鉀脅迫下過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和突變體植株的根長(zhǎng)、開(kāi)花時(shí)間及成熟期性狀比較結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)植株開(kāi)花早于突變體;籽粒千粒重高于突變體;在一定范圍內(nèi),鉀含量越低根越顯著長(zhǎng)于突變體,說(shuō)明過(guò)表達(dá)植株對(duì)低鉀有更好的適應(yīng)性。本試驗(yàn)構(gòu)建了RNA干擾表達(dá)載體p RNAi-Zm HAK1,為進(jìn)行玉米遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ),期望利用RNAi技術(shù)干擾玉米中Zm HAK1基因的表達(dá),來(lái)進(jìn)一步探究該基因的功能。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)基因擬南芥 ZmHAK1基因 表達(dá)分析 鉀效率 RNA干擾載體
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 英文縮寫(xiě)詞表12-13
• 第1章 文獻(xiàn)綜述13-23
• 1.1 鉀資源狀況13-15
• 1.1.1 土壤供鉀狀況13-14
• 1.1.2 鉀肥資源狀況14-15
• 1.2 植物鉀營(yíng)養(yǎng)性狀改良15-21
• 1.2.1 植物鉀效率的遺傳基礎(chǔ)15-16
• 1.2.2 植物鉀效率的分子基礎(chǔ)16-19
• 1.2.3 植物鉀營(yíng)養(yǎng)性狀的改良19
• 1.2.4 植物遺傳轉(zhuǎn)化方法概述19-21
• 1.3 RNA干擾技術(shù)21
• 1.4 研究目的與意義21-23
• 第2章 ZmHAK1轉(zhuǎn)化擬南芥突變體23-31
• 2.1 材料與方法23-27
• 2.1.1 試驗(yàn)材料與試劑23-24
• 2.1.2 植物材料的培養(yǎng)及處理24
• 2.1.3 pCambia1301- ZmHAK1轉(zhuǎn)化菌種的驗(yàn)證24-25
• 2.1.4 蘸花侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥突變體25-26
• 2.1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選26
• 2.1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA的PCR驗(yàn)證26-27
• 2.2 結(jié)果與分析27-30
• 2.2.1 pCambia1301-ZmHAK1轉(zhuǎn)化菌種的驗(yàn)證27
• 2.2.2 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選27-28
• 2.2.3 T1代陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子DNA的PCR鑒定28-29
• 2.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的穩(wěn)定性檢測(cè)29-30
• 2.3 討論30-31
• 第3章 ZmHAK1在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)分析31-39
• 3.1 材料與方法31-34
• 3.1.1 植物材料及處理31
• 3.1.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥總RNA提取31-32
• 3.1.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA32-33
• 3.1.4 qRT-PCR定量分析33-34
• 3.2 結(jié)果與分析34-37
• 3.2.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥提取的總RNA34
• 3.2.2 ZmHAK1基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中組織特異性表達(dá)分析34-35
• 3.2.3 ZmHAK1基因低鉀脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析35-37
• 3.3 討論37-39
• 第4章 轉(zhuǎn)ZmHAK1基因擬南芥鉀效率探索39-53
• 4.1 材料與方法39-45
• 4.1.1 植物材料39
• 4.1.2 鉀吸收動(dòng)力學(xué)研究39-40
• 4.1.3 鉀含量測(cè)定40-41
• 4.1.4 生理指標(biāo)測(cè)定41-45
• 4.2 結(jié)果與分析45-51
• 4.2.1 鉀吸收動(dòng)力學(xué)特性分析45-47
• 4.2.2 鉀利用機(jī)制研究47-51
• 4.3 討論51-53
• 第5章 轉(zhuǎn)ZmHAK1基因擬南芥表型分析53-57
• 5.1 材料與方法53-54
• 5.1.1 材料處理53-54
• 5.1.2 試驗(yàn)方法54
• 5.2 結(jié)果與分析54-56
• 5.2.1 擬南芥花期54-55
• 5.2.2 根伸長(zhǎng)量55
• 5.2.3 成熟期性狀55-56
• 5.3 討論56-57
• 第6章 pRNAi- ZmHAK1表達(dá)載體的構(gòu)建57-71
• 6.1 材料與方法57-65
• 6.1.1 試驗(yàn)材料57-58
• 6.1.2 正、反向片段的獲得58-63
• 6.1.3 正向片段插入中間載體pSK-int63-64
• 6.1.4 反向片段插入重組質(zhì)粒pSK-int-ZmZ64
• 6.1.5 RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建64-65
• 6.2 結(jié)果與分析65-69
• 6.2.1 重組質(zhì)粒T-ZmGRZ、T-ZmGRF的驗(yàn)證65-66
• 6.2.2 正向片段插入到中間載體pSK-int66-67
• 6.2.3 反向片段插入到重組質(zhì)粒pSK-int-ZmZ67-68
• 6.2.4 反向重復(fù)序列插入到表達(dá)載體68-69
• 6.3 討論69-71
• 研究結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-80
• 作者簡(jiǎn)介80-81
• 致謝81

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