本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)ZmHAK1基因擬南芥吸收轉(zhuǎn)運鉀離子的研究及RNA干擾載體的構(gòu)建

  更多相關(guān)文章： 轉(zhuǎn)基因擬南芥 ZmHAK1基因 表達分析 鉀效率 RNA干擾載體

【摘要】：鉀是農(nóng)作物生產(chǎn)、豐收必不可少的營養(yǎng)元素,但我國耕地土壤普遍缺鉀,鉀素缺乏已成為作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的限制因子。植物在逆境脅迫下生長,有許多非生物脅迫應答基因參與調(diào)控,使植物自身適應環(huán)境。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,許多低鉀脅迫應答基因被發(fā)現(xiàn)。研究這些耐低鉀基因的功能,培育出新的耐低鉀農(nóng)作物品種,將其應用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,是高效利用土壤中鉀素營養(yǎng)的有效途徑。低鉀脅迫下,植物主要利用高親和鉀轉(zhuǎn)運體吸收介質(zhì)中的K+,因此研究高親和鉀轉(zhuǎn)運體吸收轉(zhuǎn)運鉀的能力具有實踐意義。為此,本文進行了轉(zhuǎn)Zm HAK1基因擬南芥的研究及RNAi表達載體的構(gòu)建,旨在探索Zm HAK1基因?qū)χ参镂辙D(zhuǎn)運鉀離子能力的影響。本試驗利用蘸花侵染法將已構(gòu)建的p Cambia1301-Zm HAK1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到高親和鉀轉(zhuǎn)運體基因缺失的擬南芥突變體中。利用濃度為0.1%的Basta對轉(zhuǎn)化植株進行篩選,對存活的陽性植株進行Bar基因和Zm HAK1基因的PCR檢測,檢測結(jié)果表明成功獲得了轉(zhuǎn)Zm HAK1基因的T1代擬南芥植株。繼續(xù)繁殖、篩選、鑒定獲得能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因擬南芥T5代。以T5代植株為材料進行q RT-PCR試驗。結(jié)果表明,Zm HAK1基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株各組織均有表達,無表達特異性,但在根、莖中表達量較高。對轉(zhuǎn)基因擬南芥在持續(xù)低鉀脅迫處理下根、莖、花中Zm HAK1基因表達水平進行分析,結(jié)果表明Zm HAK1基因的表達受低鉀脅迫誘導,不同組織中目的基因表達量不同程度上調(diào),且維持較高表達水平,其中根部目的基因表達量上調(diào)最高,72h時的表達量達到處理前的19倍。鉀吸收動力學試驗結(jié)果表明,過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥具有較大的Imax值和較小的Km、Cmin、β值,并且在較短的時間內(nèi)達到吸收平衡,說明過表達擬南芥植株有較強的吸鉀能力。鉀含量相關(guān)指標分析結(jié)果表明,過表達擬南芥有較大的AKA和KUI值,說明過表達植株不僅有較強的吸鉀能力,而且有較好利用鉀的能力。主要逆境生理指標分析測定結(jié)果表明,過表達擬南芥植株在低鉀脅迫環(huán)境中,細胞受傷害程度明顯低于突變體對照,進一步說明過表達擬南芥植株耐低鉀脅迫能力較突變體對照有所提高,能夠?qū)Φ外浢{迫產(chǎn)生響應。低鉀脅迫下過表達轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和突變體植株的根長、開花時間及成熟期性狀比較結(jié)果表明,過表達植株開花早于突變體;籽粒千粒重高于突變體;在一定范圍內(nèi),鉀含量越低根越顯著長于突變體,說明過表達植株對低鉀有更好的適應性。本試驗構(gòu)建了RNA干擾表達載體p RNAi-Zm HAK1,為進行玉米遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎,期望利用RNAi技術(shù)干擾玉米中Zm HAK1基因的表達,來進一步探究該基因的功能。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)基因擬南芥 ZmHAK1基因 表達分析 鉀效率 RNA干擾載體
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 英文縮寫詞表12-13
• 第1章 文獻綜述13-23
• 1.1 鉀資源狀況13-15
• 1.1.1 土壤供鉀狀況13-14
• 1.1.2 鉀肥資源狀況14-15
• 1.2 植物鉀營養(yǎng)性狀改良15-21
• 1.2.1 植物鉀效率的遺傳基礎15-16
• 1.2.2 植物鉀效率的分子基礎16-19
• 1.2.3 植物鉀營養(yǎng)性狀的改良19
• 1.2.4 植物遺傳轉(zhuǎn)化方法概述19-21
• 1.3 RNA干擾技術(shù)21
• 1.4 研究目的與意義21-23
• 第2章 ZmHAK1轉(zhuǎn)化擬南芥突變體23-31
• 2.1 材料與方法23-27
• 2.1.1 試驗材料與試劑23-24
• 2.1.2 植物材料的培養(yǎng)及處理24
• 2.1.3 pCambia1301- ZmHAK1轉(zhuǎn)化菌種的驗證24-25
• 2.1.4 蘸花侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥突變體25-26
• 2.1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選26
• 2.1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA的PCR驗證26-27
• 2.2 結(jié)果與分析27-30
• 2.2.1 pCambia1301-ZmHAK1轉(zhuǎn)化菌種的驗證27
• 2.2.2 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選27-28
• 2.2.3 T1代陽性轉(zhuǎn)化子DNA的PCR鑒定28-29
• 2.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的穩(wěn)定性檢測29-30
• 2.3 討論30-31
• 第3章 ZmHAK1在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達分析31-39
• 3.1 材料與方法31-34
• 3.1.1 植物材料及處理31
• 3.1.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥總RNA提取31-32
• 3.1.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA32-33
• 3.1.4 qRT-PCR定量分析33-34
• 3.2 結(jié)果與分析34-37
• 3.2.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥提取的總RNA34
• 3.2.2 ZmHAK1基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中組織特異性表達分析34-35
• 3.2.3 ZmHAK1基因低鉀脅迫誘導表達分析35-37
• 3.3 討論37-39
• 第4章 轉(zhuǎn)ZmHAK1基因擬南芥鉀效率探索39-53
• 4.1 材料與方法39-45
• 4.1.1 植物材料39
• 4.1.2 鉀吸收動力學研究39-40
• 4.1.3 鉀含量測定40-41
• 4.1.4 生理指標測定41-45
• 4.2 結(jié)果與分析45-51
• 4.2.1 鉀吸收動力學特性分析45-47
• 4.2.2 鉀利用機制研究47-51
• 4.3 討論51-53
• 第5章 轉(zhuǎn)ZmHAK1基因擬南芥表型分析53-57
• 5.1 材料與方法53-54
• 5.1.1 材料處理53-54
• 5.1.2 試驗方法54
• 5.2 結(jié)果與分析54-56
• 5.2.1 擬南芥花期54-55
• 5.2.2 根伸長量55
• 5.2.3 成熟期性狀55-56
• 5.3 討論56-57
• 第6章 pRNAi- ZmHAK1表達載體的構(gòu)建57-71
• 6.1 材料與方法57-65
• 6.1.1 試驗材料57-58
• 6.1.2 正、反向片段的獲得58-63
• 6.1.3 正向片段插入中間載體pSK-int63-64
• 6.1.4 反向片段插入重組質(zhì)粒pSK-int-ZmZ64
• 6.1.5 RNAi表達載體的構(gòu)建64-65
• 6.2 結(jié)果與分析65-69
• 6.2.1 重組質(zhì)粒T-ZmGRZ、T-ZmGRF的驗證65-66
• 6.2.2 正向片段插入到中間載體pSK-int66-67
• 6.2.3 反向片段插入到重組質(zhì)粒pSK-int-ZmZ67-68
• 6.2.4 反向重復序列插入到表達載體68-69
• 6.3 討論69-71
• 研究結(jié)論71-72
• 參考文獻72-80
• 作者簡介80-81
• 致謝81

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