本文關(guān)鍵詞：熱脫硫弧菌解旋酶基因TyPif1的原核表達(dá)、純化及功能分析

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【摘要】：【目的】通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得熱脫硫弧菌(Thermodesulfovibrio yellowstonii H.)Pif1解旋酶(TyPif1),研究TyPif1解旋酶的嗜熱特性和解旋機(jī)理。【方法】將Typif1解旋酶編碼區(qū)和SUMO促溶標(biāo)簽編碼區(qū)融合連入pET15b獲得重組表達(dá)載體pET15b-SUMO-TyPif1,將該重組載體導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)Ni-NTA柱親和純化獲得融合蛋白,SUMO蛋白酶切除標(biāo)簽,再經(jīng)Ni-NTA柱去除標(biāo)簽蛋白及SUMO蛋白酶,經(jīng)Heparin柱進(jìn)一步純化最終獲得TyPif1全長蛋白。通過熒光各向異性、圓二色譜(CD)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析TyPif1解旋酶的DNA結(jié)合活性、解旋活性以及二級結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性�！窘Y(jié)果】獲得了純度大于95%的TyPif1蛋白,1L培養(yǎng)基可以獲得約10mg純度大于95%的蛋白;TyPif1解旋酶結(jié)合單鏈DNA和G4DNA的活性明顯高于雙鏈DNA;TyPif1具有較高的解旋G4DNA的活性,在25~60℃下其二級結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定,且解旋速率隨溫度升高而增大,25~50℃TyPif1的解旋速率由0.09s-1增大到0.23s-1�！窘Y(jié)論】表達(dá)純化了熱脫硫弧菌TyPif1解旋酶,其不僅具有良好的熱穩(wěn)定性,同時(shí)具有特異的結(jié)合和解旋G4DNA的能力。
【作者單位】： 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;
【關(guān)鍵詞】： 熱脫硫弧菌 Pif解旋酶 蛋白表達(dá)純化 DNA結(jié)合活性 DNA解旋活性
【基金】：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370798,11304252)
【分類號】：Q936
【正文快照】： 解旋酶是一類利用水解NTP釋放的能量沿著DNA磷酸骨架移動(dòng)的分子“馬達(dá)”,參與核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組與修復(fù)等過程,在生物體內(nèi)扮演著重要的角色[1-2]。其相關(guān)基因突變會(huì)導(dǎo)致遺傳病的發(fā)生,如Werner綜合癥、Bloom綜合癥等[3-4]。Pif1解旋酶是高度保守的5′→3′方向解旋酶,屬于解

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