本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)β-甘露聚糖酶基因克隆豬的制備與分析

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【摘要】：【目的】將前期構(gòu)建的含有黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA的質(zhì)粒p PSPBGP-manA轉(zhuǎn)染杜洛克豬胎兒成纖維細(xì)胞,利用G418篩選出轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系,通過體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)出轉(zhuǎn)manA基因豬,利用分子生物學(xué)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因豬進(jìn)行陽性鑒定、基因及蛋白表達(dá)水平的檢測(cè),同時(shí)測(cè)定轉(zhuǎn)基因豬唾液β-甘露聚糖酶酶活、糞便營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量,旨在為生產(chǎn)及進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)manA基因豬提供一些科學(xué)依據(jù)�！痉椒ā坑孟拗菩詢�(nèi)切酶Not I將質(zhì)粒p PSPBGP-manA線性化并通過脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)入杜洛克豬胎兒成纖維細(xì)胞,然后用不同濃度的G418進(jìn)行篩選、維持培養(yǎng),將篩選后的細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植生產(chǎn)克隆豬;克隆豬出生后采取尾組織樣用酚-氯仿法提取基因組DNA進(jìn)行PCR及Southern blotting鑒定陽性轉(zhuǎn)基因豬;收集轉(zhuǎn)基因豬唾液并利用DNS法進(jìn)行β-甘露聚糖酶活性測(cè)定,同時(shí)收集轉(zhuǎn)基因豬糞便測(cè)定糞便中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量;取轉(zhuǎn)基因豬的腮腺、頜下腺、舌下腺、心臟、肝臟等組織并用Triol法提取RNA,然后進(jìn)行RT-PCR鑒定manA基因的表達(dá),再進(jìn)行相對(duì)定量PCR檢測(cè)manA基因在不同個(gè)體及組織間的表達(dá)差異;通過Western blotting技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因豬外源性manA基因的蛋白表達(dá)水平�！窘Y(jié)果】經(jīng)G418篩選后進(jìn)行PCR鑒定得到陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系;通過體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)出21頭克隆豬,經(jīng)PCR及Southern blotting鑒定出16頭轉(zhuǎn)基因豬,陽性率為76%;轉(zhuǎn)基因豬唾液中β-甘露聚糖酶的活性為(0.092±0.003)U·m L-1,糞便中粗蛋白含量明顯降低;經(jīng)RT-PCR、相對(duì)定量PCR鑒定,manA基因在轉(zhuǎn)基因豬腮腺和舌下腺組織中特異表達(dá),其它組織不表達(dá),腮腺組織表達(dá)量高于舌下腺組織;Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在腮腺和舌下腺組織中有manA的表達(dá)�！窘Y(jié)論】通過G418篩選得到轉(zhuǎn)manA基因細(xì)胞系并成功得到轉(zhuǎn)manA基因豬,外源manA基因能夠在轉(zhuǎn)基因豬中腮腺和舌下腺組織特異性表達(dá),為轉(zhuǎn)manA基因豬的生產(chǎn)及進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院龍巖學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì);華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心;
【關(guān)鍵詞】： β-甘露聚糖酶 轉(zhuǎn)基因克隆豬 制備 檢測(cè)分析
【基金】：國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX08006004) 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011A020102003) 龍巖學(xué)院青年教師攀登項(xiàng)目(LQ2014008)
【分類號(hào)】：S828
【正文快照】： Generation of Beta-Mannanase Transgenic Clone Pig and AnalysisZHANG Mao2,ZHANG Guan-guan1,LIU De-wu1,CAI Geng-yuan1,WU Zhen-fang1,LI Zi-cong1(1College of Animal Science,South China Agricultural University/National Engineering Research Center for Breeding

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蔡發(fā)國(guó);曹云鶴;陳權(quán)軍;;新型酶制劑——β-甘露聚糖酶的研究進(jìn)展[J];飼料研究;2007年11期

2 徐紅蕊;;β-甘露聚糖酶之國(guó)內(nèi)外最新研究概況[J];湖南飼料;2008年02期

3 馬鑫;趙仲麟;李亮;陳明;林敏;平淑珍;;芽孢桿菌β-甘露聚糖酶基因的克隆及表達(dá)[J];生物技術(shù)通報(bào);2009年02期

4 徐麗萍;;飼用β-甘露聚糖酶的研究及應(yīng)用[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2009年09期

5 崔栩;曹云鶴;李瑞國(guó);;β-甘露聚糖酶研究進(jìn)展[J];中國(guó)畜牧雜志;2010年15期

6 謝志恒;崔細(xì)鵬;周平發(fā);史寶軍;;飼用β-甘露聚糖酶的研究進(jìn)展[J];飼料博覽;2012年12期

7 王梅;石t，

本文編號(hào)：665023