本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)β-甘露聚糖酶基因克隆豬的制備與分析

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【摘要】：【目的】將前期構(gòu)建的含有黑曲霉β-甘露聚糖酶基因manA的質(zhì)粒p PSPBGP-manA轉(zhuǎn)染杜洛克豬胎兒成纖維細胞,利用G418篩選出轉(zhuǎn)基因細胞系,通過體細胞核移植方法生產(chǎn)出轉(zhuǎn)manA基因豬,利用分子生物學(xué)方法對轉(zhuǎn)基因豬進行陽性鑒定、基因及蛋白表達水平的檢測,同時測定轉(zhuǎn)基因豬唾液β-甘露聚糖酶酶活、糞便營養(yǎng)物質(zhì)含量,旨在為生產(chǎn)及進一步研究轉(zhuǎn)manA基因豬提供一些科學(xué)依據(jù)�！痉椒ā坑孟拗菩詢�(nèi)切酶Not I將質(zhì)粒p PSPBGP-manA線性化并通過脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)入杜洛克豬胎兒成纖維細胞,然后用不同濃度的G418進行篩選、維持培養(yǎng),將篩選后的細胞進行體細胞核移植生產(chǎn)克隆豬;克隆豬出生后采取尾組織樣用酚-氯仿法提取基因組DNA進行PCR及Southern blotting鑒定陽性轉(zhuǎn)基因豬;收集轉(zhuǎn)基因豬唾液并利用DNS法進行β-甘露聚糖酶活性測定,同時收集轉(zhuǎn)基因豬糞便測定糞便中營養(yǎng)物質(zhì)含量;取轉(zhuǎn)基因豬的腮腺、頜下腺、舌下腺、心臟、肝臟等組織并用Triol法提取RNA,然后進行RT-PCR鑒定manA基因的表達,再進行相對定量PCR檢測manA基因在不同個體及組織間的表達差異;通過Western blotting技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因豬外源性manA基因的蛋白表達水平�！窘Y(jié)果】經(jīng)G418篩選后進行PCR鑒定得到陽性轉(zhuǎn)基因細胞系;通過體細胞核移植方法生產(chǎn)出21頭克隆豬,經(jīng)PCR及Southern blotting鑒定出16頭轉(zhuǎn)基因豬,陽性率為76%;轉(zhuǎn)基因豬唾液中β-甘露聚糖酶的活性為(0.092±0.003)U·m L-1,糞便中粗蛋白含量明顯降低;經(jīng)RT-PCR、相對定量PCR鑒定,manA基因在轉(zhuǎn)基因豬腮腺和舌下腺組織中特異表達,其它組織不表達,腮腺組織表達量高于舌下腺組織;Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)在腮腺和舌下腺組織中有manA的表達。【結(jié)論】通過G418篩選得到轉(zhuǎn)manA基因細胞系并成功得到轉(zhuǎn)manA基因豬,外源manA基因能夠在轉(zhuǎn)基因豬中腮腺和舌下腺組織特異性表達,為轉(zhuǎn)manA基因豬的生產(chǎn)及進一步研究奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院龍巖學(xué)院動物營養(yǎng)科研創(chuàng)新團隊;華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心;
【關(guān)鍵詞】： β-甘露聚糖酶 轉(zhuǎn)基因克隆豬 制備 檢測分析
【基金】：國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08006004) 廣東省科技計劃項目(2011A020102003) 龍巖學(xué)院青年教師攀登項目(LQ2014008)
【分類號】：S828
【正文快照】： Generation of Beta-Mannanase Transgenic Clone Pig and AnalysisZHANG Mao2,ZHANG Guan-guan1,LIU De-wu1,CAI Geng-yuan1,WU Zhen-fang1,LI Zi-cong1(1College of Animal Science,South China Agricultural University/National Engineering Research Center for Breeding

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 蔡發(fā)國;曹云鶴;陳權(quán)軍;;新型酶制劑——β-甘露聚糖酶的研究進展[J];飼料研究;2007年11期

2 徐紅蕊;;β-甘露聚糖酶之國內(nèi)外最新研究概況[J];湖南飼料;2008年02期

3 馬鑫;趙仲麟;李亮;陳明;林敏;平淑珍;;芽孢桿菌β-甘露聚糖酶基因的克隆及表達[J];生物技術(shù)通報;2009年02期

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6 謝志恒;崔細鵬;周平發(fā);史寶軍;;飼用β-甘露聚糖酶的研究進展[J];飼料博覽;2012年12期

7 王梅;石t，

本文編號：665023