本文關(guān)鍵詞：枳抗逆基因的克隆及功能鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《華中農(nóng)業(yè)大學》 2011年

枳抗逆基因的克隆及功能鑒定

黃小三  

【摘要】：柑橘是我國南方重要的水果之一,其產(chǎn)業(yè)發(fā)展對促進地區(qū)經(jīng)濟具有重要作用。近年來柑橘產(chǎn)業(yè)雖然取得了巨大的發(fā)展,但常受到干旱、鹽及低溫等各種非生物逆境脅迫,因此,如何高效培育柑橘抗逆新品種成為當前育種學家亟需解決的課題。柑橘育種方法主要有常規(guī)育種、芽變選種和基因工程等,但常規(guī)育種存在雌雄性敗育,珠心胚干擾,遺傳高度雜合等問題,而芽變選種培育周期過長,隨著生物技術(shù)水平的提高,特別是基因工程的發(fā)展,為柑橘的育種提供了一條新的途徑�？鼓鏅C理解析及重要基因克隆是基因工程的前題,是柑橘分子育種的關(guān)鍵。但目前柑橘抗性基因的克隆較少,鑒定出功能的基因更少,這嚴重阻礙了柑橘抗逆分子育種的步伐。從前人的研究得知,轉(zhuǎn)錄因子ABF、bHLH、ICE1及蛋白激酶MAPK在植物抗非生物脅迫中起重要作用,因此本研究從枳中分離、克隆得到ABF,MAPK、bHLH及ICE1基因,并對他們進行抗逆功能鑒定。其目的是為了深入解析抗性基因的分子機理,獲得擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的柑橘抗性基因資源。主要研究結(jié)果如下： 1.采用電子克隆從枳中克隆得到ABA響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子(PtrABF),它包含1347bp的開放閱讀框,編碼448個氨基酸,預測蛋白質(zhì)分子量為48kD,等電點9.66。多序列比對顯示PtrABF與其它物種的ABF有很高的同源性。PtrABF定位于細胞核,有轉(zhuǎn)錄激活活性,能與ABRE元件結(jié)合,表明它是一個轉(zhuǎn)錄因子。表達模式分析顯示它能被脫水、低溫及ABA誘導。煙草中超表達PtrABF,表明轉(zhuǎn)基因植株比未轉(zhuǎn)化植株的抗脫水和抗旱能力顯著提高。脫水和干旱條件下轉(zhuǎn)基因植株比未轉(zhuǎn)化植株活性氧積累低,三種抗氧化酶的活性及基因表達量均較高。另外,在干旱處理前后,9個逆境相關(guān)基因的表達量在轉(zhuǎn)基因煙草中都比非轉(zhuǎn)基因植株高。所有結(jié)果顯示,PtrABF轉(zhuǎn)基因植株抗旱能力顯著提高。 2.利用電子克隆及RACE技術(shù)從枳中分離克隆出PtrMAPK,該基因包含1128bp開放性閱讀框,編碼375個氨基酸,蛋白質(zhì)分子量為43kD,等電點為5.51。生物信息學分析表明PtrMAPK包括11個保守的激酶結(jié)構(gòu)域和一個磷酸化位點,亞細胞定位表明它定位于細胞核。PtrMAPK受干旱及低溫的誘導但不受鹽的誘導。與未轉(zhuǎn)化植株相比,PtrMAPK轉(zhuǎn)基因煙草超表達植株的抗脫水和抗旱能力明顯提高,進一步研究表明,抗性增強與抗氧化酶活性提高相關(guān)。此外,轉(zhuǎn)基因煙草在干旱處理前后,相關(guān)逆境響應(yīng)基因的表達量明顯上升。研究結(jié)果表明,PtrMAPK轉(zhuǎn)基因植株具有較強的抗旱能力。 3.從枳中克隆出PtrbHLH基因,該基因全長1921bp,它包括1464bp的開放性閱讀框,編碼487個氨基酸,等電點為5.30,分子量預測為53.6kD。多序列比對表明其編碼的氨基酸序列中含有保守的ZIP結(jié)構(gòu)域、bHLH結(jié)構(gòu)域、C末段區(qū)域及SUMO結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PtrbHLH定位于細胞核,具有轉(zhuǎn)錄激活活性。ExPASy網(wǎng)站中的Signal P軟件預測表明PtrbHLH氨基酸序列中具有一個核定位信號(NLS)及一個bHLH DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；SMART預測PtrbHLH氨基酸序列中含有一個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。PtrbHLH受低溫、脫水及鹽的誘導。超表達PtrbHLH的轉(zhuǎn)基因檸檬和煙草植株的抗寒能力提高,但其RNAi-PtrbHLH轉(zhuǎn)入枳使其抗性下降。采用Affymetrix芯片雜交分析表明,PtrbHLH的轉(zhuǎn)基因檸檬中有108個基因上調(diào),其中包括與H202清除有關(guān)的POD基因。進一步研究表明,超表達PtrbHLH的轉(zhuǎn)基因植株(煙草和檸檬)中POD活性強,在氧化脅迫下抗性也增強。但采用POD抑制劑處理轉(zhuǎn)基因煙草后,H202清除能力及抗寒性減弱。這些結(jié)果表明,PtrbHLH是通過調(diào)控POD來增強植物的抗寒能力。 4.采用電子克隆和RACE等手段從枳中克隆出PtrICE1基因,該基因包含一個1680bp的開放閱讀框,編碼559個氨基酸,蛋白預測的分子量為61kD,等電點為5.27。生物信息學分析顯示PtrICE1氨基酸序列與其它植物氨基酸同源性較高,有兩個保守的bHLH結(jié)構(gòu)域和一個SUMO結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PtrICE1定位于細胞核,有很強的轉(zhuǎn)錄激活活性以及能與順式作用元件MYC結(jié)合,這些都說明它是一個轉(zhuǎn)錄因子。在低溫、脫水、鹽及脫落酸誘導下PtrICE1的轉(zhuǎn)錄水平都有很大的提高,表明PtrICE1能受這些非生物逆境的誘導。PtrICE1在CaM35S啟動子下在煙草中的超表達分析顯示,它的抗寒能力得到很大的提高。

【關(guān)鍵詞】：
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：S666
【目錄】：

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5 趙明煒;王恩多;;亮氨酰-tRNA合成酶CP1結(jié)構(gòu)域?qū)τ诜N屬間tRNA~(Leu)的識別至關(guān)重要[A];第七屆全國酶學學術(shù)討論會論文摘要集[C];2004年

6 傅成波;杜延順;黃秉仁;謝云飛;苑玉和;白氡;崔迎彬;;TRAF6與RanBPM相互作用的研究[A];第十次中國生物物理學術(shù)大會論文摘要集[C];2006年

7 于冰;繆澤鴻;蔣軼;李美紅;楊娜;李婷;丁健;;c-Jun的非轉(zhuǎn)錄功能:與ODD結(jié)構(gòu)域結(jié)合地阻斷缺氧誘導因子HIF-1泛素化降解[A];2009醫(yī)學前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學術(shù)會議論文集[C];2009年

8 劉慧萍;柴玉波;陳蘇民;王志珍;;蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域的克隆與活性研究[A];生命科學與生物技術(shù)：中國科協(xié)第三屆青年學術(shù)年會論文集[C];1998年

9 賈衛(wèi);金伯泉;張新海;楊琨;朱勇;劉雪松;李琦;;CD226(PTA1)分子D1結(jié)構(gòu)域參與NK和CTL的功能[A];中國免疫學會第四屆學術(shù)大會會議議程及論文摘要集[C];2002年

10 李祥;張家海;曹贊霞;吳季輝;施蘊渝;;GOPC蛋白PDZ結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)及其與Neuroligin羧基末端的相互作用[A];第十次中國生物物理學術(shù)大會論文摘要集[C];2006年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 通訊員石慧瓊 記者 鄧宏鷹 鐘少鴻;[N];中國食品報;2010年

2 醫(yī)學院;[N];新清華;2011年

3 吳一福;[N];中國醫(yī)藥報;2005年

4 記者　彭德倩;[N];解放日報;2006年

5 劉鐵　詹鋒 本報記者 陳岳海;[N];四川日報;2009年

6 張雙虎;[N];農(nóng)資導報;2011年

7 白毅;[N];中國醫(yī)藥報;2008年

8 記者 項錚;[N];科技日報;2005年

9 記者 陳忠權(quán);[N];天津日報;2008年

10 牛金輝;[N];新疆科技報(漢);2009年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 黃小三;枳抗逆基因的克隆及功能鑒定[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2011年

2 房莎莎;植物BAG蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究[D];南開大學;2013年

3 吳益民;三個含SCAN結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白基因ZNF191、ZNF396和ZNF397研究[D];復旦大學;2002年

4 何華偉;肌酸激酶結(jié)構(gòu)域相互作用與活性中心極性微環(huán)境的研究[D];清華大學;2007年

5 徐進新;SNX16和SNX11的結(jié)構(gòu)生物學研究[D];中國科學技術(shù)大學;2012年

6 張金秀;Patj/Pals1/Mals2三元復合體形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)研究[D];南開大學;2012年

7 劉奕彤;Ccd1激活Wnt信號通路的分子機制[D];清華大學;2010年

8 吳勃;人源蛋白Vav2和Arap3的結(jié)構(gòu)與功能研究[D];中國科學技術(shù)大學;2010年

9 毛大慶;野油菜黃單胞菌感光相關(guān)基因功能研究[D];清華大學;2011年

10 張中保;玉米抗旱相關(guān)基因的克隆與功能分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2010年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 朱小芳;枳兩個基因PtrMYB和PtrF3E1的抗逆功能分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2012年

2 夏思思;海洋放線菌氨基酸腺苷化結(jié)構(gòu)域的克隆、表達和酶活性測定[D];華中師范大學;2012年

3 梁琳;顆粒裂解肽抗菌結(jié)構(gòu)域的重組表達和生物活性分析[D];安徽大學;2011年

4 蔡榮號;玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmWRKY58基因的克隆及其抗逆功能研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學;2013年

5 唐自鐘;內(nèi)切葡聚糖酶基因同源和異源結(jié)構(gòu)域重構(gòu)研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學;2011年

6 劉冰冰;藍細菌光敏色素結(jié)構(gòu)域體內(nèi)重組及光化學性質(zhì)研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2013年

7 王軍一;人工嵌合啟動子的構(gòu)建及其脅迫誘導性分析[D];山東師范大學;2005年

8 王潔琳;陸地棉耐鹽相關(guān)GhERF基因的克隆及分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2012年

9 李麗;Connexin 31與p62相互作用的研究[D];中南大學;2012年

10 楊獻光;水稻糖原合成酶激酶基因（OsGSK1）的克隆及功能分析[D];河北師范大學;2005年

  本文關(guān)鍵詞：枳抗逆基因的克隆及功能鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：64146