發(fā)布時(shí)間：2017-08-02 14:07

  本文關(guān)鍵詞：基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鹽生草（Halogeton glomeratus）耐鹽基因的克隆與驗(yàn)證

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【摘要】：鹽堿土是我國(guó)重要的土地資源。鹽脅迫是全球范圍內(nèi)的非生物脅迫之一,影響植物的正常生理活動(dòng)。鹽生植物能夠在高鹽堿的環(huán)境中自由生長(zhǎng),在我國(guó)資源利用中具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。探尋鹽生植物的耐鹽機(jī)理、篩選耐鹽基因和耐鹽品種已逐漸成為耐鹽堿方法中更為經(jīng)濟(jì)有效的一部分。鹽生草(Halogeton glomeratus)屬于藜科鹽生草屬一年生植物,主要分布于甘肅、青海等地的荒漠和鹽堿地。從生理學(xué)角度分析表明,鹽生草在鹽脅迫下表現(xiàn)較強(qiáng)的耐鹽性。經(jīng)鹽脅迫后,葉肉細(xì)胞的液泡中可以積累大量鈉離子。從分子生物學(xué)角度研討鹽生草耐鹽機(jī)理,挖掘耐鹽基因,對(duì)培育耐鹽新品種具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)是在鹽脅迫后鹽生草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上,篩選了4個(gè)經(jīng)鹽脅迫后表達(dá)上調(diào)的基因進(jìn)行研究,本研究的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下:(一)通過(guò)3’RACE技術(shù),獲取了三個(gè)基因的3’端序列,經(jīng)拼接后,獲得Unigene22136片段長(zhǎng)為609bp、Unigene33874片段長(zhǎng)為471p和Unigene34165片段長(zhǎng)為760bp。(二)利用3’RACE和5’RACE技術(shù)獲取了CL5227基因的cDNA全長(zhǎng),該基因全長(zhǎng)為501bp,其中包括208bp的5’UTR區(qū)和164bp的3’UTR區(qū),開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為129bp,編碼42個(gè)氨基酸,其分子量為4.56kD,經(jīng)生物信息學(xué)分析表明,CL5227基因蛋白屬于疏水性堿性蛋白,該蛋白無(wú)信號(hào)肽及跨膜區(qū);經(jīng)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)初步定位于線粒體內(nèi),分析推測(cè)其具有生長(zhǎng)因子、結(jié)構(gòu)蛋白等功能。(三)從鹽生草中克隆得到CL5227基因,并成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-CL5227,將其成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404;通過(guò)蘸花法侵染轉(zhuǎn)化擬南芥,通過(guò)初步篩選與PCR鑒定獲得T1代抗性植株。為進(jìn)一步進(jìn)行基因功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：鹽生草 鹽脅迫 RACE 植物表達(dá)載體
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要2-3
• Summary3-5
• 縮略詞表5-9
• 第一章 文獻(xiàn)綜述9-19
• 1.1 植物的耐鹽機(jī)制9-12
• 1.1.1 滲透調(diào)節(jié)9-10
• 1.1.2 離子區(qū)隔化10-11
• 1.1.3 活性氧的清除11
• 1.1.4 光合途徑的改變11
• 1.1.5 激素與蛋白調(diào)節(jié)11-12
• 1.1.6 植物個(gè)體應(yīng)對(duì)鹽脅迫的方式12
• 1.2 植物耐鹽基因的研究12-13
• 1.3 新一代高通量測(cè)序技術(shù)13-14
• 1.3.1 轉(zhuǎn)錄組Denovo測(cè)序14
• 1.4 新基因全長(zhǎng)cDNA克隆策略14-16
• 1.4.1 圖位克隆15
• 1.4.2 電子基因克隆15
• 1.4.3 cDNA末端快速擴(kuò)增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）15-16
• 1.5 鹽生植物研究進(jìn)展16-17
• 1.6 本研究的目的意義17-18
• 技術(shù)路線18-19
• 第二章 鹽生草耐鹽相關(guān)基因的克隆19-45
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19-21
• 2.1.1 植物材料19
• 2.1.2 主要試劑19
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備19
• 2.1.4 PCR引物設(shè)計(jì)與合成19-21
• 2.2 試驗(yàn)方法21-29
• 2.2.1 鹽生草總RNA的提取與檢測(cè)21-22
• 2.2.2 cDNA第一條鏈的制備22
• 2.2.3 3’race模板的制備22-23
• 2.2.4 5’race模板的制備23-24
• 2.2.5 鹽生草耐鹽相關(guān)基因的克隆24-26
• 2.2.6 基因的測(cè)序及全長(zhǎng)序列的拼接26-29
• 2.2.7 目的基因的生物信息學(xué)分析29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析29-43
• 2.3.1 總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)29-30
• 2.3.2 鹽生草Unigene22136基因的克隆與序列拼接30-31
• 2.3.3 鹽生草Unigene 33874 基因的克隆與序列拼接31-33
• 2.3.4 鹽生草Unigene34165基因的克隆與序列拼接33-34
• 2.3.5 鹽生草Cl5227基因的克隆與序列拼接34-36
• 2.3.6 鹽生草Cl5227基因的生物信息學(xué)分析36-43
• 2.4 討論43-45
• 2.4.1 鹽生草Cl5227基因的蛋白功能確定43-44
• 2.4.2 實(shí)驗(yàn)后期展望44-45
• 第三章 鹽生草Cl5227基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化45-58
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料45
• 3.1.1 植物材料45
• 3.1.2 主要試劑45
• 3.1.3 載體與菌株45
• 3.1.4 主要儀器設(shè)備45
• 3.1.5 引物設(shè)計(jì)與合成45
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法45-52
• 3.2.1 鹽生草總RNA的提取與檢測(cè)45-46
• 3.2.2 cDNA第一條鏈的制備46
• 3.2.3 目的基因的擴(kuò)增46
• 3.2.4 目的基因的回收46
• 3.2.5 目的基因連接克隆載體46-47
• 3.2.6 植物表達(dá)載體pCAMBIA3300-Cl5227的構(gòu)建47-49
• 3.2.7 植物表達(dá)載體pCAMBIA3300- Cl5227的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化49-50
• 3.2.8 侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥50-52
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析52-57
• 3.3.1 鹽生草Cl5227基因全長(zhǎng)的獲得52-53
• 3.3.2 中間載體雙酶切鑒定53-54
• 3.3.3 表達(dá)載體pCAMBIA3300-Cl5227的鑒定54-55
• 3.3.4 pCAMBIA3300-Cl5227轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌55
• 3.3.5 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化55-56
• 3.3.6 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定56-57
• 3.4 討論57-58
• 第四章 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-67
• 致謝67-68
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介68-69
• 作者簡(jiǎn)介69

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本文編號(hào)：609635