本文關(guān)鍵詞：光敏色素基因在轉(zhuǎn)基因玉米株系基因組的整合位點(diǎn)

  更多相關(guān)文章： 基因組 整合位點(diǎn) 玉米 光敏色素基因 轉(zhuǎn)基因

【摘要】：外源基因或表達(dá)結(jié)構(gòu)的插入位點(diǎn)及整合方式,不僅關(guān)系外源基因的表達(dá),而且可能引起插入位點(diǎn)突變,影響內(nèi)源基因表達(dá),是轉(zhuǎn)基因機(jī)理研究和安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。玉米基因組比擬南芥和水稻等模式植物更為復(fù)雜,而且存在大量的重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座序列。因此,在玉米轉(zhuǎn)基因研究中,外源基因插入位點(diǎn)及整合方式的鑒定更為重要,也更為困難。本實(shí)驗(yàn)以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米內(nèi)源光敏色素基因Phy A1、PhyA2和PhyB1的6個(gè)不同世代株系和陽(yáng)性株為材料,經(jīng)特異PCR純合性檢驗(yàn)后,用高效熱不對(duì)稱交錯(cuò)式PCR擴(kuò)增T-DNA整合位點(diǎn)的側(cè)翼序列,分析T-DNA的玉米基因組中的整合規(guī)律,討論其對(duì)表現(xiàn)型的影響。所得結(jié)果如下：1.用兩套巢式物分別擴(kuò)增相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因及其啟動(dòng)子序列片段,表達(dá)載體pCAMBIA1390-Ubi-PhyA1-T-nos和pCAMBIA 1390-Ubi-PhyB1-T-nos分別轉(zhuǎn)化的T7代株系全部為陽(yáng)性植株,純合率為100%。表達(dá)載體pTF101.1-Ubi-PhyA1-T-nos轉(zhuǎn)化的T6代株系大部分為陽(yáng)性植株,純合率為90%。表達(dá)載體pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos轉(zhuǎn)化的T3代株系純合率為40%。在表達(dá)載體pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉(zhuǎn)化To代植株中,檢測(cè)出2個(gè)獨(dú)立的陽(yáng)性植株,陽(yáng)性率為5%。2.hiTAIL-PCR和基因組步移擴(kuò)增及序列分析結(jié)果,pCAMBIA1390-Ubi-PhyAl-T-nos轉(zhuǎn)化T7代株系、pCAMBIA 1390-Ubi-PhyB1-T-nos轉(zhuǎn)化T7代株系、pTF101.1-Ubi-PhyA1-T-nos轉(zhuǎn)化T6代株系、pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos轉(zhuǎn)化T3代株系以及pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉(zhuǎn)化T0代陽(yáng)性株1和2的T-DNA整合位點(diǎn),分別位于玉米基因組第1染色體第284557834與284557835堿基、第9染色體第61944355與61944356堿基、第1染色體第26981167與26981168堿基、第6染色體第96491356與96491357堿基、第3染色體第125567445與125567446堿基和第4染色體第98934902與98934903堿基之間。3.根據(jù)上述6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系或T0代陽(yáng)性株的T-DNA整合位點(diǎn),在玉米基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索上下游10 kb以內(nèi)的功能基因序列、重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座子序列。結(jié)果表明,pCAMBIA1390-Ubi-PhyAl-T-T-nos和pCAMBIA 1390-Ubi-PhyB1-T-nos分別轉(zhuǎn)化T7代株系,pTF101.1-Ubi-PhyA1-T-nos轉(zhuǎn)化T6代株系和pTF101.1一Ubi-PhyB1-T-nos轉(zhuǎn)化T0代陽(yáng)性株2的T-DNA整合位點(diǎn),_上-下游10 kb范圍未發(fā)現(xiàn)功能基因序列、重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座子序列。pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos轉(zhuǎn)化T3代株系的T-DNA整合位點(diǎn)下游1050 bp有一編碼WRKY40轉(zhuǎn)錄因子的基因,上游70 kb還有一個(gè)功能未知基因。pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉(zhuǎn)化T0代陽(yáng)性株1的T-DNA整合位點(diǎn)下游20 bp有一編碼精氨酸t(yī)RNA的基因,上游200 bp還有一個(gè)基因功能未知基因。4.上述6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和T0代陽(yáng)性株T-DNA左右邊界共12個(gè)整合位點(diǎn),共有4種整合模式：(1) T-DNA整合的斷裂點(diǎn)發(fā)生在邊界序列內(nèi),整合進(jìn)玉米基因組的T-DNA不附帶表達(dá)載體骨架和填充序列。(2) T-DNA整合的斷裂點(diǎn)發(fā)生在邊界序列以外,整合進(jìn)玉米基因組的T-DNA附帶部分表達(dá)載體骨架序列。(3) T-DNA邊界與玉米基因組序列之間填充進(jìn)一段與表達(dá)載體和玉米基因組均不同源的序列。(4) T-DNA整合的斷裂點(diǎn)發(fā)生在邊界序列以內(nèi),造成T-DNA邊界序列的缺失。此外,在這12個(gè)整合的T-DNA左右邊界序列中,均發(fā)現(xiàn)不同程度的堿基替代和缺失突變。綜上所述,T-DNA在玉米基因組的整合位點(diǎn)和模式是多種多樣的,每一轉(zhuǎn)化事件各不相同。對(duì)于T-DNA整合位點(diǎn)接近或重合于功能基因序列的情況,在轉(zhuǎn)基因安全性評(píng)價(jià)中應(yīng)專門進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)。表達(dá)載體pCAMBIA1390-Ubi-PhyA1-T-nos和pCAMBIA1390-Ubi-PhyB1-T-nos分別轉(zhuǎn)化的T7代株系出現(xiàn)的株高和穗位高等性狀的改變,是由過(guò)量表達(dá)的內(nèi)源基因ZmPhyA1和ZmPhyB1引起。
【關(guān)鍵詞】：基因組 整合位點(diǎn) 玉米 光敏色素基因 轉(zhuǎn)基因
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1. 文獻(xiàn)綜述11-19
• 1.1 T-DNA整合特點(diǎn)12-13
• 1.1.1 T-DNA修復(fù)模型12-13
• 1.1.2 T-DNA整合對(duì)受體基因組的影響13
• 1.2 T-DNA整合模式研究進(jìn)展13-15
• 1.3 熱不對(duì)稱交錯(cuò)式PCR15-18
• 1.3.1 TAIL-PCR原理15-16
• 1.3.2 hiTAIL-PCR的優(yōu)點(diǎn)16-17
• 1.3.3 基因組步移17-18
• 1.4 目的意義18-19
• 2. 材料和方法19-28
• 2.1 基因組DNA提取19
• 2.2 轉(zhuǎn)基因株系的純合性檢測(cè)19-22
• 2.3 hiTAIL-PCR擴(kuò)增22-24
• 2.3.1 引物設(shè)計(jì)22-23
• 2.3.2 hiTAIL-PCR第一輪擴(kuò)增23
• 2.3.3 hiTAIL-PCR第二輪擴(kuò)增23
• 2.3.4 hiTAIL-PCR第三輪擴(kuò)增23-24
• 2.3.5 凝膠電泳分離24
• 2.4 特異片段的亞克隆及測(cè)序24-25
• 2.4.1 亞克隆載體連接24
• 2.4.2 感受態(tài)細(xì)胞制備24
• 2.4.3 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化24-25
• 2.4.4 特異片段的亞克隆及測(cè)序25
• 2.5 基因組序列比對(duì)25-26
• 2.5.1 側(cè)翼序列與表達(dá)載體比對(duì)25
• 2.5.2 側(cè)翼序列與玉米基因組比對(duì)25-26
• 2.5.3 邊界序列與填充序列分析26
• 2.6 基因組步移26-28
• 3. 結(jié)果與分析28-41
• 3.1 轉(zhuǎn)基因株系的純合性28-29
• 3.2 hiTAIL-PCR擴(kuò)增的特異片段29-31
• 3.3 T-DNA整合位點(diǎn)31-37
• 3.3.1 pCAMBIA1390-Ubi-PhyB1-T-nos轉(zhuǎn)化的T_7代株系31
• 3.3.2 pTF101.1-Ubi-PhyAl-T-nos轉(zhuǎn)化的T_6代株系31-32
• 3.3.3 pTF101.1-Ubi-PhyA2-T-nos轉(zhuǎn)化的T_3代株系32-33
• 3.3.4 pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉(zhuǎn)化的T_0代陽(yáng)性株133-34
• 3.3.5 pCAMBIA1390-Ubi-PhyA1-T-nos轉(zhuǎn)化的T_7代株系34-36
• 3.3.6 pTF101.1-Ubi-PhyB1-T-nos轉(zhuǎn)化的T_0代陽(yáng)性株236-37
• 3.4 整合位點(diǎn)側(cè)翼的玉米基因組序列37-39
• 3.5 邊界序列在整合中的突變39-41
• 4. 討論41-43
• 4.1 T-DNA整合模式41-42
• 4.2 T-DNA整合對(duì)受體基因的影響42-43
• 5. 參考文獻(xiàn)43-48
• 致謝48-49
• 附錄49-55
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文55

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