本文關(guān)鍵詞：條紋斑竹鯊肝臟中GSTP1基因的miRNA調(diào)控及其相互作用蛋白的研究

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【摘要】：肝臟再生是肝臟區(qū)別于其他臟器的顯著特點(diǎn),肝再生分子調(diào)控機(jī)理的研究也一直是肝臟研究領(lǐng)域的重點(diǎn)之一。目前,研究肝再生的模式生物一般為小鼠、大鼠或家兔,以海洋生物為研究對(duì)象的很少,對(duì)處于早期進(jìn)化重要地位的軟骨魚類的研究未見報(bào)道。條紋斑竹鯊因其體積小、分布廣、全年均可捕撈的特點(diǎn)常作為軟骨魚類的代表生物;同時(shí)條紋斑竹鯊肝臟約占內(nèi)臟總體積的75%且具有免疫調(diào)節(jié)功能,所以我們選擇以條紋斑竹鯊為模式生物進(jìn)行肝再生的研究。本研究通過對(duì)條紋斑竹鯊正常肝臟轉(zhuǎn)錄組和損傷肝臟轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行差異表達(dá)分析獲得359個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs),其中包括142個(gè)下調(diào)基因,217個(gè)上調(diào)基因。然后通過差異基因GO富集分析、表達(dá)水平聚類分析和qRT-PCR驗(yàn)證,篩選出與肝再生相關(guān)且表達(dá)量顯著差異的13個(gè)基因,其中10個(gè)基因(slc22a16,Slc39a4,Slc1a2,NR5A2,hoga1,ESR2,DIO1,Atp2a2,comp51558_c0,comp43528_c0)的表達(dá)量有明顯上調(diào),3個(gè)基因(GSTP1,comp44386_c0,comp60069_c3)的表達(dá)量明顯下調(diào),其中GSTP1基因是首次在條紋斑竹鯊肝臟轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)的肝再生相關(guān)基因。為了進(jìn)一步研究GSTP1基因的miRNA調(diào)控,本文運(yùn)用miRanda和Target Scan生物信息學(xué)軟件在條紋斑竹鯊小RNA文庫(kù)中篩選出3個(gè)與GSTP1具有靶向性的miRNAs,分別是chp-let-7a、chp-miR-143-3p_R+1_1ss21CA和chp-miR-143。隨后利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證,初步證明chp-miR-143與GSTP1具有靶向性,這為后續(xù)研究肝再生調(diào)控機(jī)理提供依據(jù)。本文通過構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a(+)-Shark GSTP1獲得工程菌,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得到重組蛋白His-Shark GSTP1,將純化后的重組蛋白免疫家兔制備多克隆抗體。采取心臟取血的方式得到家兔全血,離心獲得血清,并使用間接ELISA法測(cè)定效價(jià),效價(jià)為1:51200。為降低血清中雜質(zhì)的影響,我們采用蛋白A親和層析的方法對(duì)兔血清進(jìn)行純化,并運(yùn)用Western Blotting和MALDI-TOF MS在鯊魚肝臟中首次驗(yàn)證了Shark GSTP1蛋白的存在。通過Co-IP方法從鯊魚肝臟組織中的成功免疫沉淀出Shark GSTP1,并分離鑒定出與GSTP1互作的蛋白,大小約在70~100 kDa,為以后研究GSTP1與其他蛋白的相互作用、參與信號(hào)通路的調(diào)控等提供依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：條紋斑竹鯊 肝再生 GSTP1 轉(zhuǎn)錄組 miRNAs
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;Q51
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-12
• 縮略語12-13
• 第一章 緒論13-16
• 1 條紋斑竹鯊的研究概況13
• 2 GSTP1的研究進(jìn)展13-14
• 3 miRNA的研究進(jìn)展14
• 4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究現(xiàn)狀14-16
• 第二章 實(shí)驗(yàn)方案16-18
• 1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c意義16
• 2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容16-17
• 3 實(shí)驗(yàn)流程圖17-18
• 第三章 鯊魚肝臟中GSTP1的發(fā)現(xiàn)及鑒定18-33
• 1 材料與試劑18-19
• 1.1 材料18
• 1.2 試劑18-19
• 2 方法19-26
• 2.1 鯊魚的飼養(yǎng)19
• 2.2 鯊魚肝臟 1/3 部分切除再生模型建立19-20
• 2.2.1 手術(shù)前準(zhǔn)備19-20
• 2.2.2 肝臟 1/3 部分切除手術(shù)20
• 2.3 條紋斑竹鯊肝再生相關(guān)基因的篩選與GSTP1的發(fā)現(xiàn)20-26
• 2.3.1 轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)流程20
• 2.3.2 生物信息分析流程20-22
• 2.3.3 GO功能顯著性富集分析22
• 2.3.4 富集性差異基因整合表達(dá)模式22-23
• 2.3.5 對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行Real-Time PCR驗(yàn)證23-26
• 3 結(jié)果26-31
• 3.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量預(yù)處理結(jié)果總覽26
• 3.2 篩選出的差異基因26-28
• 3.3 差異基因的GO富集結(jié)果28-29
• 3.4 富集性差異基因整合表達(dá)模式分析結(jié)果29
• 3.5 總RNA提取結(jié)果29-30
• 3.6 qRT-PCR結(jié)果分析30-31
• 4 討論31-33
• 第四章 篩選調(diào)控GSTP1基因表達(dá)的miRNA33-43
• 1 材料與試劑33
• 1.1 材料33
• 1.2 試劑33
• 2 方法33-38
• 2.1 Shark GSTP13’UTR的獲得33
• 2.2 靶定miRNA的篩選33
• 2.3 3'UTR突變序列的引物設(shè)計(jì)33-34
• 2.4 3'UTR突變序列PCR擴(kuò)增34-35
• 2.5 PCR產(chǎn)物割膠回收35
• 2.6 雙酶切及連接反應(yīng)35
• 2.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化35
• 2.7.1 用CaCl_2法制備E. coli TG1、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞35
• 2.7.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化35
• 2.8 重組質(zhì)粒的篩選和鑒定35-37
• 2.8.1 篩選陽性克隆35-36
• 2.8.2 質(zhì)粒的小量制備36
• 2.8.3 菌液PCR鑒定36
• 2.8.4 雙酶切鑒定36-37
• 2.8.5 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定37
• 2.9 篩選能靶定到GSTP1的miRNAs并合成minics37
• 2.10 質(zhì)粒的提取37
• 2.11 細(xì)胞轉(zhuǎn)染37-38
• 2.11.1 人肝癌Huh7細(xì)胞培養(yǎng)37
• 2.11.2 分別將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Huh 7 細(xì)胞37-38
• 2.12 細(xì)胞裂解與熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)38
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-41
• 3.1 篩選靶定到Shark GSTP13’UTR的miRNA38
• 3.2 3’UTR突變序列PCR擴(kuò)增結(jié)果38-39
• 3.3 3’UTR及其突變序列重組質(zhì)粒的鑒定39-40
• 3.4 質(zhì)粒提取40
• 3.5 熒光信號(hào)值的處理40-41
• 4 討論41-43
• 第五章 GSTP1多克隆抗體的制備43-57
• 1 條紋斑竹鯊GSTP1基因的原核表達(dá)及產(chǎn)物純化43-49
• 1.1 材料與試劑43-46
• 1.1.1 材料43
• 1.1.2 試劑和儀器43
• 1.1.3 主要試劑的配置43-46
• 1.2 方法46-49
• 1.2.1 GSTP1基因的PCR擴(kuò)增46-47
• 1.2.2 shark-GSTP1的抗原性分析47
• 1.2.3 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-GSTP1的構(gòu)建47
• 1.2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化47-48
• 1.2.5 重組質(zhì)粒的篩選和鑒定48
• 1.2.6 重組質(zhì)粒在E. coli BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)48
• 1.2.7 Shark GSTP1的純化48
• 1.2.8 純化抗原的檢測(cè)（Western Blotting）48-49
• 2 重組Shark GSTP1多克隆抗體的制備49-51
• 2.1 材料與試劑49-50
• 2.1.1 材料與試劑49
• 2.1.2 主要試劑的配制49-50
• 2.2 方法50-51
• 2.2.1 抗原的制備50
• 2.2.2 免疫動(dòng)物及多抗的制備50
• 2.2.3 血清多抗效價(jià)的測(cè)定（間接ELISA）50-51
• 2.2.4 抗體特異性的Western Blotting鑒定51
• 3 結(jié)果51-55
• 3.1 GSTP1的抗原表位分析51-52
• 3.2 重組表達(dá)載體pET-28a(+)-GSTP1的構(gòu)建52-53
• 3.2.1 GSTP1的PCR擴(kuò)增52
• 3.2.2 重組表達(dá)載體pET-28a(+)-GSTP1的鑒定52-53
• 3.2.3 重組表達(dá)載體pET-28a(+)-GSTP1的序列測(cè)定53
• 3.3 蛋白His- Shark GSTP1表達(dá)純化的結(jié)果53-54
• 3.4 血清多抗效價(jià)檢測(cè)54
• 3.5 血清多抗的Western Blotting分析54-55
• 4 討論55-57
• 第六章 Shark GSTP1蛋白及其互作蛋白的鑒定57-63
• 1 試劑與儀器57
• 1.1 試劑57
• 1.2 儀器57
• 2 方法57-59
• 2.1 兔血清抗體的純化57-58
• 2.2 質(zhì)譜鑒定58
• 2.3 Shark GSTP1互作蛋白的研究（Co-IP）58-59
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果59-62
• 3.1 多抗的親和純化59-60
• 3.2 Co-IP的結(jié)果60-61
• 3.3 質(zhì)譜分析結(jié)果61-62
• 4 討論62-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 致謝69

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本文編號(hào)：571252