本文關(guān)鍵詞：攜帶IL24和MnSOD雙基因溶瘤痘苗病毒抗癌作用研究

  更多相關(guān)文章： 溶瘤痘病毒 雙基因 抗癌研究 ZD55 溶瘤腺病毒 類肝癌干細(xì)胞

【摘要】：I癌癥是目前嚴(yán)重威脅人類健康的最主要疾病之一,因此探索有效治療癌癥的方法顯得十分重要。第一、二代溶瘤病毒對(duì)癌癥的治療都不理想。溶瘤痘苗病毒作為第三代溶瘤病毒有著更多的優(yōu)勢(shì)。它具有宿主范圍廣、復(fù)制速度快、副作用明確、允許插入長(zhǎng)片段外源基因和引起抗腫瘤免疫反應(yīng)等特點(diǎn)。刪除溶瘤痘苗病毒的B18R或TK非必須基因,可以增強(qiáng)病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性且不影響其復(fù)制,故溶瘤痘苗病毒是一種理想的基因治療載體。目前已經(jīng)有報(bào)道稱,在溶瘤痘苗病毒TK區(qū)插入一個(gè)外源基因有很好的抗癌效果。為了增強(qiáng)溶瘤痘苗病毒對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效果,我們?cè)诙幻绮《镜腡K區(qū)和B18R區(qū)分別插入IL24和MnSOD基因,構(gòu)建了OncoPox-IL24-MnSOD重組病毒。IL24和MnSOD基因是最近幾年發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子,在多種癌細(xì)胞中低表達(dá),能抑制正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等效果。本文通過同源重組的方法將外源基因IL24和MnSOD依次插到痘苗病毒的TK區(qū)和B18R區(qū),單獨(dú)在TK區(qū)插入MnSOD基因,成功構(gòu)建了OncoPox-IL24-MnSOD,OncoPox-MnSOD兩種病毒,使外源基因在癌細(xì)胞中表達(dá),從而達(dá)到誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的目的。通過MTT實(shí)驗(yàn)和Hoechst染色實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)OncoPox-IL24、OncoPox-MnSOD和OncoPox-IL24-MnSOD三種病毒對(duì)不同的癌細(xì)胞具有不同的殺傷效果,但OncoPox-IL24-MnSOD殺傷效果要明顯優(yōu)于OncoPox-IL24和OncoPox-MnSOD單個(gè)病毒。故雙基因溶瘤痘苗病毒對(duì)癌癥的治療可能會(huì)成為一種新的治療策略。II癌癥干細(xì)胞,也被稱作腫瘤起始細(xì)胞,具有高轉(zhuǎn)移、高耐藥性和高致瘤性的特征,而且對(duì)腫瘤的發(fā)生、維持和復(fù)發(fā)起著關(guān)鍵性的作用。據(jù)報(bào)道,溶瘤腺病毒能夠靶向和殺死癌癥干細(xì)胞,被認(rèn)為是一種很有前景的抗癌藥物。ZD55能夠靶向肝癌并且表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性效應(yīng);然而,當(dāng)其靶向肝癌干細(xì)胞時(shí)是否具有同樣地殺傷效力仍需進(jìn)一步探討。我們利用懸浮培養(yǎng)的方法富集類肝癌干細(xì)胞,此種細(xì)胞具有肝癌干細(xì)胞的特征,如自我更新和分化能力、癌癥干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)和具有抗化療作用等。本研究結(jié)果顯示,ZD55在對(duì)類肝癌干細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)和溶瘤效果方面具有很好的效果,ZD55在體外能夠非常明顯的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此,ZD55可能會(huì)成為靶向肝癌干細(xì)胞的一種很有前景的治療藥物,為肝癌患者獲得較好的臨床結(jié)果。
【關(guān)鍵詞】：溶瘤痘病毒 雙基因 抗癌研究 ZD55 溶瘤腺病毒 類肝癌干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 縮略詞8-11
• 第一章 攜帶IL24和MnSOD雙基因溶瘤痘苗病毒抗癌作用研究11-43
• 1.1 引言11-13
• 1.1.1 癌癥靶向基因病毒治療11
• 1.1.2 溶瘤痘苗病毒簡(jiǎn)介11-12
• 1.1.2.1 溶瘤痘苗病毒的特點(diǎn)11-12
• 1.1.2.2 溶瘤痘苗病毒的改造12
• 1.1.3 IL24基因概述12-13
• 1.1.4 MnSOD基因概述13
• 1.1.5 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵饬x13
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料13-18
• 1.2.1 質(zhì)粒與菌株13-14
• 1.2.2 痘苗病毒14
• 1.2.3 工具酶及生化試劑14-15
• 1.2.4 主要溶液及配制方法15-16
• 1.2.5 本實(shí)驗(yàn)所用到的細(xì)胞株16
• 1.2.6 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備16-17
• 1.2.7 引物序列17-18
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法18-32
• 1.3.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建常用方法18-20
• 1.3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及病毒同源重組示意圖20-23
• 1.3.3 重組質(zhì)粒pCB-B18R-MnSOD的構(gòu)建23-26
• 1.3.4 細(xì)胞的復(fù)蘇26-27
• 1.3.5 細(xì)胞的傳代27
• 1.3.6 細(xì)胞的凍存27
• 1.3.7 攜帶基因的溶瘤痘苗病毒OncoPox-MnSOD,OncoPox-IL24-MnSOD的包裝27
• 1.3.8 藥物篩選，，挑空斑篩選目的病毒27-28
• 1.3.9 病毒基因組的抽提28-29
• 1.3.10 痘苗病毒的鑒定29
• 1.3.11 痘病毒滴度測(cè)定29
• 1.3.12 Vero-Cre穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建29-30
• 1.3.13 Western blot檢測(cè)MnSOD蛋白表達(dá)水平30-31
• 1.3.14 MTT檢測(cè)31
• 1.3.15 痘病毒的大量擴(kuò)增及純化31
• 1.3.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析31-32
• 1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-42
• 1.4.1 pCB-B18R-Loxp-gpt-EGFP-Loxp的左臂的構(gòu)建及鑒定結(jié)果32-33
• 1.4.2 pCB-B18R的右臂的構(gòu)架及鑒定結(jié)果33-34
• 1.4.3 pCB-B18R-MnSOD質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定34-35
• 1.4.4 溶瘤痘苗病毒OncoPox-IL24-MnSOD的包裝35-36
• 1.4.5 OncoPox-IL24-MnSOD重組病毒的鑒定36-37
• 1.4.6 OncoPox-MnSOD重組病毒的鑒定37-38
• 1.4.7 Western blot檢測(cè)OncoPox-IL24-MnSOD、OncoPox-MnSOD病毒中MnSOD蛋白水平表達(dá)38-39
• 1.4.8 Vero細(xì)胞puro最小劑量的篩選39
• 1.4.9 puro篩選Cre表達(dá)陽性細(xì)胞39-40
• 1.4.10 Western blot檢測(cè)Vero-Cre穩(wěn)轉(zhuǎn)株Cre酶的表達(dá)40
• 1.4.11 MTT檢測(cè)重組病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果40-41
• 1.4.12 Hoechst33342染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡41-42
• 1.5.結(jié)論42-43
• 第二章 溶瘤腺病毒ZD55對(duì)類肝癌干細(xì)胞殺傷作用的研究43-58
• 2.1 引言43-44
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料44-45
• 2.2.1 試劑及試劑盒44
• 2.2.2 溶液配制44
• 2.2.3 抗體44
• 2.2.4 病毒44
• 2.2.5 細(xì)胞系44-45
• 2.2.6 主要的實(shí)驗(yàn)儀器45
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法45-47
• 2.3.1 類肝癌干細(xì)胞球的懸浮培養(yǎng)45
• 2.3.2 病毒的滴度測(cè)定45-46
• 2.3.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)46
• 2.3.4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性46
• 2.3.5 結(jié)晶紫染色法檢測(cè)細(xì)胞毒性46
• 2.3.6 小室侵襲實(shí)驗(yàn)46-47
• 2.3.7 Westen bloting實(shí)驗(yàn)47
• 2.3.8 細(xì)胞周期檢測(cè)47
• 2.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析47
• 2.4 結(jié)果47-56
• 2.4.1 無血清懸浮培養(yǎng)可以獲得Sphere細(xì)胞47-48
• 2.4.2 Western blot檢測(cè)Huh7 sphere細(xì)胞里蛋白表達(dá)的變化情況48-49
• 2.4.3 Huh7 sphere細(xì)胞具有耐藥性49
• 2.4.4 Huh7 sphere細(xì)胞處于靜息狀態(tài)49-50
• 2.4.5 Huh7 sphere具有分化能力50-51
• 2.4.6 Huh7 sphere具有更強(qiáng)的侵襲能力51
• 2.4.7 Huh7 sphere細(xì)胞對(duì)THO, ZD55沒有耐藥性51-52
• 2.4.8 ZD55對(duì)Huh7 sphere細(xì)胞殺傷作用52-53
• 2.4.9 ZD55能誘導(dǎo)Huh7 sphere細(xì)胞凋亡53-55
• 2.4.10 Western blot檢測(cè)ZD55通過caspase途徑誘導(dǎo)Huh7 sphere細(xì)胞凋亡55-56
• 2.5 結(jié)論56-58
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 致謝61

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6 謝立移;樊e

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