本文關(guān)鍵詞：家蠶小肽tal-like基因的功能研究

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【摘要】：研究發(fā)現(xiàn)真核生物基因組中有大量的DNA生成了非典型性的轉(zhuǎn)錄本,它們的的功能引起了廣泛的爭議。這些轉(zhuǎn)錄本中包含很多小的開放讀碼框(small open reading frames,sORFs),這些sORFs起初被認為是不能翻譯成蛋白的RNAs,然而,越來越多的證據(jù)表明其中的一些sORFs可以翻譯成為小肽,而且它們的作用被嚴重低估了。sORFs翻譯成的小肽可能代表一類被忽視的生物活性分子,近年來的研究表明這些小肽在發(fā)育、分化等生物過程中具有重要的功能。其中對tal-like基因相關(guān)小肽的研究較為深入,該基因最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)。在果蠅中,Tal控制基因的表達和組織的形成,作為一個結(jié)構(gòu)和形態(tài)發(fā)生的鏈接,對果蠅的生長發(fā)育起到非常重要的作用。家蠶作為一種典型的模式經(jīng)濟昆蟲,在生長發(fā)育的諸多方面與果蠅有很多相似的地方。本研究在成功克隆了家蠶tal-like基因(Bombyx mori tal-like gene,Bmtal)的基礎(chǔ)上,檢測了Bmtal基因在家蠶五齡三天不同組織的表達水平,研究了過表達Bmtal和抑制Bmtal對家蠶ovo基因(Bmovo)及部分信號通路基因表達的影響,利用RNA-Seq技術(shù)開展了過表達Bmtal的Bm N細胞與對照組BmN細胞的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究,為理解Bmtal基因?qū)倚Q生長發(fā)育的影響提供了新的線索。主要結(jié)果如下:1家蠶tal-like基因的表達譜分析為了研究家蠶tal-like基因的功能,根據(jù)序列設(shè)計引物進行RT-PCR,成功克隆到1661 bp的Bmtal全長cDNA序列。結(jié)構(gòu)分析顯示,Bmtal基因中存在多個sORFs,其中前四個sORFs(A1-A4)分別編碼11-12個氨基酸、且序列相似的小肽,緊跟著一個編碼32個氨基酸的sORFs(B)。其結(jié)構(gòu)模式與果蠅的非常相似,提示Bmtal基因的功能有可能與果蠅的相似。通過熒光定量PCR(Real-time PCR)分析了Bmtal基因在家蠶五齡三天各種組織的表達水平,結(jié)果顯示,Bmtal基因在五齡三天的氣管叢、馬氏管、絲腺中表達量較高,在性腺中也有表達。2 BmTal的亞細胞定位在果蠅中,越來越多的證據(jù)表明tal-like基因?qū)�體的生長發(fā)育起到至關(guān)重要的作用,為了探討B(tài)mtal的表達規(guī)律以及細胞定位特征,將Bmtal的功能區(qū)域編碼序列與DsRed基因融合,克隆進pET-32a(+),在E.coil中成功表達了重組蛋白。并利用免疫小鼠制備了多克隆抗體。細胞定位結(jié)果顯示,BmTal定位在BmN細胞的細胞核中。3過表達和抑制Bmtal基因?qū)movo基因及其他信號通路基因的影響為了進一步探討B(tài)mtal基因的功能,本研究通過過表達和RNAi的方法調(diào)查了上調(diào)和下調(diào)Bmtal基因?qū)movo基因及其他信號通路基因表達水平的影響。結(jié)果顯示,過表達的Bmtal基因可以調(diào)控ovo基因的表達水平,對其他信號通路的部分基因的表達水平也起到明顯的影響。4 BmTal相互作用蛋白的篩選與鑒定為了研究Tal-小肽在家蠶BmN細胞中的相互作用蛋白,采用免疫共沉淀技術(shù)從過表達BmTal的家蠶BmN細胞中篩選互作蛋白,然后對與BmTal互作的候選蛋白進行質(zhì)譜鑒定,共鑒定到6種候選蛋白(14-3-3蛋白zeta、纖毛和鞭毛關(guān)聯(lián)蛋白、鞭毛軸絲關(guān)聯(lián)蛋白mst101、多聚泛素、U3小核仁RNA互作蛋白、細胞生長調(diào)節(jié)核仁蛋白)。信息分析結(jié)果顯示,這些蛋白涉及到信號傳導(dǎo)、細胞增殖分化、蛋白降解、細胞表面突起形成、核苷酸代謝等各個方面。表明BmTal可能通過多種方式調(diào)節(jié)生物學(xué)過程。5過表達Bmtal基因在基因組水平上的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用將Bmtal基因克隆進昆蟲表達載體pIZT-V5/His構(gòu)建重組質(zhì)粒pIZT/V5-His-tal,將pIZT/V5-His-tal和pIZT/V5His質(zhì)粒轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞,通過Zeocin連續(xù)篩選兩個月后,獲得轉(zhuǎn)化2組轉(zhuǎn)化細胞,利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-Seq)進行了比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。結(jié)果顯示,差異表達基因主要集中在與細胞的生長分化及增值過程中。表明Bmtal基因在細胞的生長分化及增值過程中起重要作用。
【關(guān)鍵詞】：家蠶 tal-like基因 小肽 過表達
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第一章 文獻綜述12-25
• 1 小肽概述12-15
• 1.1 小肽的定義12
• 1.2 小肽的生成12-14
• 1.3 小肽的保守性及篩選鑒定方法14-15
• 1.4 小肽生物學(xué)功能15
• 2 tal-like基因相關(guān)小肽的結(jié)構(gòu)和功能研究15-18
• 3 小肽的研究前景18-19
• 4 研究目的與內(nèi)容19-20
• 4.1 研究的目的與意義19-20
• 4.2 研究的主要內(nèi)容20
• 4.3 技術(shù)路線20
• 參考文獻20-25
• 第二章 家蠶tal-like基因的表達譜分析25-39
• 1 材料與方法25-32
• 1.1 實驗材料25-27
• 1.2 常用儀器27
• 1.3 實驗方法27-32
• 2 結(jié)果與分析32-36
• 2.1 家蠶tal-like基因的克隆32-35
• 2.2 Bmtal的表達譜分析35-36
• 3 討論36-37
• 參考文獻37-39
• 第三章 BmTal的多抗制備及亞細胞定位39-50
• 1 材料與方法39-45
• 1.1 材料與試劑39-40
• 1.2 主要實驗試劑的配制40-42
• 1.3 實驗方法42-45
• 2 結(jié)果與分析45-48
• 2.1 DsRed和tal-A1融合基因表達載體的構(gòu)建45-46
• 2.2 DsRed-tal-A1的原核表達及抗體的特異性檢測46-47
• 2.3 Bmtal的亞細胞定位47-48
• 3 討論48-49
• 參考文獻49-50
• 第四章 過表達Bmtal對Bmovo及部分信號通路相關(guān)基因表達的影響50-64
• 1 材料與方法51-53
• 1.1 材料51
• 1.2 實驗方法51-53
• 2 結(jié)果與分析53-62
• 2.1 pIZT/V5-His重組載體的酶切鑒定53-54
• 2.2 轉(zhuǎn)染細胞的篩選54-55
• 2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細胞中pIZT/V5-His-tal及相關(guān)片段表達的鑒定55-56
• 2.4 過表達的Bmtal及相關(guān)功能片段對Bmovo基因的影響56-60
• 2.5 過表達Bmtal對家蠶notch、hairy和delt的影響60-61
• 2.6 過表達Bmtal對家蠶其他信號通路基因的影響61-62
• 3 討論62-63
• 參考文獻63-64
• 第五章 抑制Bmtal基因?qū)movo基因及部分信號通路相關(guān)基因表達的影響64-72
• 1 材料與方法64-66
• 1.1 材料64-65
• 1.2 實驗方法65-66
• 2 結(jié)果與分析66-70
• 2.1 不同siRNA在BmN細胞中對Bmtal基因的抑制效果66-67
• 2.2 抑制Bmtal基因后對Bmovo基因的影響67-68
• 2.3 抑制Bmtal基因后對notch、hairy、delt基因的影響68-69
• 2.4 抑制Bmtal基因后對其他信號通路基因的影響69-70
• 3 討論70
• 參考文獻70-72
• 第六章 BmTal相互作用蛋白的篩選與鑒定72-80
• 1 材料與方法72-75
• 1.1 實驗材料72-73
• 1.2 實驗方法73-75
• 2.實驗結(jié)果75-77
• 2.1 Co-IP及質(zhì)譜分析75-76
• 2.2 BmTal互作宿主蛋白的篩選與鑒定76
• 2.3 候選蛋白的功能分析76-77
• 3 討論77-78
• 參考文獻78-80
• 第七章 過表達Bmtal家蠶BmN細胞轉(zhuǎn)錄組的比較分析80-96
• 1 材料與方法81-83
• 1.1 實驗材料81
• 1.2 實驗試劑81
• 1.3 實驗方法81-83
• 2 結(jié)果與分析83-88
• 2.1 家蠶細胞中RNA的提取和質(zhì)量檢測83
• 2.2 Reads預(yù)處理及參考基因?qū)Ρ?/span>83-84
• 2.3 轉(zhuǎn)化pIZT/V5-His和pIZT/V5-His-tal的BmN細胞間表達差異分析84
• 2.4 GO 分類及富集分析84-87
• 2.5 KEGG pathway分析87-88
• 3 討論88-93
• 參考文獻93-96
• 結(jié)論96-97
• 1 已取得的成果96
• 2 有待進行的研究96-97
• 附件97-100
• 一、縮略詞表97-98
• 二、實驗所用載體圖譜98-100
• 在校期間發(fā)表論文情況100-101
• 致謝101-102

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 龔永昌;家蠶小肽tal-like基因的功能研究[D];蘇州大學(xué);2016年

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本文編號：547720