本文關鍵詞：大豆GmWRKYs基因的克隆和功能研究

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【摘要】：低磷和鋁毒害是限制南方酸性土壤大豆生產(chǎn)的重要因子。植物WRKY轉錄因子是數(shù)量眾多功能重要的轉錄因子家族之一,在調控植物適應逆境脅迫中起著重要作用。大豆基因組中含有至少127個WRKY家族成員,本研究通過生物信息學分析,篩選四個IIa型WRKY基因,并對其亞細胞定位、轉錄激活活性以及表達模式等性質進行了分析。根據(jù)所得結果,篩選出受低磷和鋁毒共同調控的GmWRKY7進行初步的功能分析。主要結果如下:1)通過比對在大豆基因組中獲得四個與擬南芥AtWRKY40高度同源的GmWRKY基因。根據(jù)這些基因在基因組上的位置,分別將其命名為GmWKRY7,GmWRKY8,GmWRKY13和GmWRKY15。這四個GmWRKY蛋白的N端均含有一個典型的WRKY結構,均屬于IIa型WRKY轉錄因子。2)酵母單雜結果顯示,這四個GmWRKY蛋白均無轉錄激活活性。進一步亞細胞定位結果顯示,四個GmWRKY的亞細胞定位不同。其中GmWRKY7和GmWKRY8定位于細胞核;GmWRKY13定位于細胞核和質體;而GmWRKY15定位在質體內(nèi)。3)對這些GmWKRY基因的表達模式分析結果顯示,營養(yǎng)元素的缺乏對這四個基因在植株不同部位的表達均有不同程度的調控。其中,缺磷和缺鐵上調了這四個GmWKRY在葉片和根系的表達水平。缺氮和缺硫均上調了這四個GmWKRY基因在葉片的表達量。但在根系中,缺氮上調了GmWKRY7和GmWRKY15的表達量,抑制了GmWRKY8的表達。缺硫則抑制了GmWKRY7和GmWRKY8的表達,對GmWRKY15的表達量無明顯影響。缺鉀除了抑制GmWRKY15在老葉的表達以外,均上調了各基因在各部位的表達。缺鈣抑制了這四個基因在新葉以及GmWRKY15在老葉的表達,但提高了GmWKRY7和GmWRKY8在老葉和根系的表達,對于GmWRKY15在根系的表達量則無顯著影響。4)激素調控了GmWKRYs基因的表達。其中,GA3、ABA和IAA能夠瞬時提高GmWRKY7的表達水平;KT則瞬時抑制該基因的表達。GmWRKY8的表達水平在GA3和IAA處理條件下瞬時上調,但在6-BA和KT處理條件下受到明顯抑制。另外,除ABA瞬時上調,6-BA和KT抑制GmWRKY15的表達水平以外,其他激素對該基因的表達無明顯影響。5)鋁處理能明顯提高大豆根尖GmWRKY7,GmWRKY8和GmWRKY15的表達。與鋁敏感基因型相比,耐鋁基因型品種中鋁調控的GmWRKY7的相對表達量較高,而鋁調控的GmWRKY8和GmWRKY15的相對表達量較高。6)選取GmWRKY7進行下一步功能分析。酵母單雜分析結果顯示GmWRKY7能夠結合GmALMT1的啟動子區(qū)域。在擬南芥中超量表達GmWRKY7,能夠顯著降低低磷脅迫下轉基因擬南芥花青素的積累。綜上所述本文研究系統(tǒng)分析了大豆四個IIa型GmWRKY轉錄因子的亞細胞定位,轉錄激活活性以及其編碼基因的表達模式等特性,并初步分析了GmWRKY7在大豆適應鋁毒和低磷脅迫中的生物學功能,為今后深入研究大豆GmWRKY轉錄因子的功能提供了有用信息。
【關鍵詞】：酸性土壤 低磷脅迫 鋁毒 GmWRKY 大豆
【學位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S565.1
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 1 前言11-17
• 1.1 植物適應低磷脅迫機制的研究進展11-12
• 1.2 植物耐鋁毒機制的研究進展12-14
• 1.3 WRKY轉錄因子家族調控植物適應低磷脅迫和鋁毒害的研究進展14-16
• 1.4 本研究的目的和意義16-17
• 2 材料與方法17-32
• 2.1 本研究總體技術路線17-18
• 2.2 實驗材料18-24
• 2.2.1 植物材料18
• 2.2.2 載體和菌株18-21
• 2.2.3 培養(yǎng)基及配方21-22
• 2.2.3.1 細菌培養(yǎng)基21
• 2.2.3.2 酵母單雜所用培養(yǎng)基21
• 2.2.3.3 MS培養(yǎng)基21-22
• 2.2.3.4 瞬時表達所用培養(yǎng)基22
• 2.2.4 主要試劑及配制22-24
• 2.2.4.1 抗生素和激素配方22-23
• 2.2.4.2 酵母轉化配方23
• 2.2.4.3 瓊脂糖凝膠電泳23
• 2.2.4.5 DNA抽提主要試劑23
• 2.2.4.6 RNA抽提主要試劑23-24
• 2.2.5 主要藥品和試劑24
• 2.3 主要設備24-25
• 2.4 實驗方法25-32
• 2.4.1 GmWRKY基因的克隆和生物信息學分析25
• 2.4.2 GmWRKY基因表達模式分析25-26
• 2.4.2.1 營養(yǎng)元素缺乏對GmWRKY基因表達的影響25
• 2.4.2.2 激素對大豆GmWRKY基因表達的影響25-26
• 2.4.2.3 鋁毒害對GmWRKY基因表達的影響26
• 2.4.3 RNA的提取和反轉錄26-27
• 2.4.3.1 植物組織基因組RNA的提取26
• 2.4.3.2 植物組織基因組RNA的反轉錄26-27
• 2.4.4 實時定量PCR及其引物設計27
• 2.4.5 DNA的提取27-28
• 2.4.6 GmWRKY基因的表達載體構建28-29
• 2.4.6.1 GmWRKYs的Gateway系統(tǒng)的載體構建28
• 2.4.6.2 GmWRKYs的亞細胞定位載體pBEGFP構建28-29
• 2.4.6.3 GmWRKYs和GmALMT1啟動子的酵母單雜載體構建29
• 2.4.7 大豆GmWRKY的亞細胞定位29-30
• 2.4.7.1 瞬時表達轉洋蔥表皮細胞29-30
• 2.4.7.2 瞬時表達轉煙草表皮細胞30
• 2.4.8 擬南芥的轉化與后代篩選30-31
• 2.4.9 擬南芥花青素含量測定31
• 2.4.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析31-32
• 3 結果與分析32-49
• 3.1 大豆IIa型WRKY基因成員的生物信息學分析32-35
• 3.1.1 大豆GmWRKY的進化樹和結構域分析32-35
• 3.2 大豆GmWRKY基因家族成員的生物學特性分析35-37
• 3.2.1 大豆GmWRKY的轉錄激活活性分析35
• 3.2.2 大豆GmWRKY的亞細胞定位分析35-37
• 3.3 大豆GmWRKYs基因表達模式分析37-44
• 3.3.1 營養(yǎng)元素的缺乏對大豆GmWRKYs基因表達模式的影響37-39
• 3.3.2 部分激素處理對大豆GmWRKYs基因表達模式的影響39-41
• 3.3.3 鋁毒害對大豆GmWRKYs基因表達模式的影響41-44
• 3.3.3.1 鋁毒害調控大豆GmWRKYs基因的表達41-42
• 3.3.3.2 鋁調控的GmWRKYs表達的自然變異分析42-44
• 3.4 大豆GmWRKY7的功能研究44-49
• 3.4.1 大豆GmWRKY7與GmALMT1啟動子相互作用的分析44-46
• 3.4.2 GmALMT1與GmWRKY7響應鋁毒害的表達模式分析46-49
• 3.4.2.2 超量表達GmWRKY7對擬南芥響應低磷脅迫的影響46-49
• 4 討論與結論49-54
• 4.1 大豆GmWRKY家族基因分析49-50
• 4.2 大豆GmWRKYs的表達模式分析50-51
• 4.3 GmWRKY與大豆鋁毒適應性的關系51
• 4.4 GmWRKY與大豆低磷適應性的關系51-52
• 4.5 結論52-54
• 致謝54-56
• 參考文獻56-61
• 附錄61-62

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：546504