本文關(guān)鍵詞：副溶血弧菌tdh2基因敲除、表達(dá)及調(diào)控機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 副溶血弧菌 tdh2毒力基因 生物學(xué)特性 TDH表達(dá) 基因調(diào)控

【摘要】：副溶血弧菌是革蘭氏陰性嗜鹽菌,主要分布在近海岸的海水、海產(chǎn)品以及鹽漬食物中。它是一種食源性致病菌,生吃或者食用未煮熟的海產(chǎn)品會(huì)引起急性腸胃炎和敗血癥。TDH被認(rèn)為是副溶血弧菌的重要致病因子,主要由tdh2基因編碼。由致病性副溶血弧菌感染引發(fā)的食物中毒已經(jīng)成為全球食品安全關(guān)注的一個(gè)重點(diǎn)。本文應(yīng)用自殺載體p DS132通過同源重組的方式對(duì)副溶血弧菌RIMD2210633進(jìn)行tdh2基因的敲除,并對(duì)tdh2基因進(jìn)行了回補(bǔ)試驗(yàn)。從副溶血弧菌的流行病學(xué)特性出發(fā),比較分析了tdh2敲除株與親本株的生物學(xué)差異。并在此基礎(chǔ)上初步探討副溶血弧菌tdh2的表達(dá)和基因調(diào)控機(jī)制。論文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.副溶血弧菌tdh2敲除株和回補(bǔ)株的構(gòu)建通過重疊PCR技術(shù)將tdh2基因編碼區(qū)的上下游同源臂進(jìn)行融合,克隆入自殺載體p DS132,并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌S17λpir中。通過接合轉(zhuǎn)移的方法將重組質(zhì)粒p DS132轉(zhuǎn)移到副溶血弧菌RIMD2210633中,經(jīng)第一輪及第二輪重組菌的篩選后獲得副溶血弧菌tdh2敲除株。為了驗(yàn)證副溶血弧菌tdh2敲除株是否發(fā)生極性突變,本章對(duì)tdh2敲除株進(jìn)行了tdh2基因的回補(bǔ)試驗(yàn)。將tdh2基因片段克隆入載體p ACYC184,通過電轉(zhuǎn)化的方式將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到副溶血弧菌tdh2敲除株中,從而得到副溶血弧菌tdh2回補(bǔ)株。本章成功獲得副溶血弧菌tdh2敲除株與回補(bǔ)株。2.副溶血弧菌tdh2敲除株的生物學(xué)特性研究致病性和非致病性副溶血弧菌在逆環(huán)境中的生存能力不同。為了研究tdh2對(duì)副溶血弧菌在逆環(huán)境中的生存能力是否產(chǎn)生影響,本章通過比較副溶血弧菌親本株與tdh2敲除株在生長、蛋白表達(dá)、耐藥性、耐酸、耐膽汁等生物學(xué)特性方面的差異性,來分析tdh2基因?qū)Ω比苎【纳飳W(xué)特性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在生長、耐藥性方面,兩者并沒有顯著性差異,而在蛋白表達(dá)、耐酸及耐膽汁方面兩者具有顯著性差異。tdh2敲除株與親本株的菌體蛋白表達(dá)在29 KD附近以及29 KD與44.3 KD之間存在差異,其中一種差異性蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定可能為細(xì)菌素C ABC轉(zhuǎn)運(yùn)ATP結(jié)合蛋白。副溶血弧菌親本株比Vp:△tdh2更能夠耐酸及耐膽汁。3.副溶血弧菌TDH表達(dá)及調(diào)控機(jī)制研究本章對(duì)tdh2基因進(jìn)行了克隆,將tdh2基因片段連接到表達(dá)載體p GEX-4T-1上,通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了TDH。同時(shí),本章采用熒光定量PCR技術(shù)檢測相關(guān)調(diào)控子m RNA的表達(dá)水平,以初步探討tdh2基因的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與副溶血弧菌親本株相比,tdh2敲除株中vp0301、vp1995、vp2553、vp1549、vpa1332、vpa1348、vp0527、vpa1361、vp2890、vpa1312和vpa313基因m RNA的表達(dá)水平具有顯著變化,結(jié)果表明tdh2基因能夠調(diào)控這11個(gè)基因,其中vp0301、vp1995、vp2553、vp1549、vpa1312和vpa313表達(dá)上調(diào),vpa1332、vpa1348、vp0527、vpa1361和vp2890表達(dá)下調(diào)。本研究對(duì)副溶血弧菌的tdh2基因進(jìn)行敲除,并對(duì)tdh2敲除株生物學(xué)特性進(jìn)行分析,在此基礎(chǔ)上初步探討了tdh2基因的調(diào)控機(jī)制,為副溶血弧菌的致病機(jī)理以及毒力基因的調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí),我們對(duì)TDH進(jìn)行了原核表達(dá),為在蛋白質(zhì)水平上對(duì)副溶血弧菌TDH的研究及基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：副溶血弧菌 tdh2毒力基因 生物學(xué)特性 TDH表達(dá) 基因調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TS201.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 緒論11-22
• 1.1 副溶血弧菌簡介11
• 1.2 副溶血弧菌的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀11-19
• 1.2.1 副溶血弧菌的流行病學(xué)研究11-12
• 1.2.2 副溶血弧菌的分子生物學(xué)研究12-17
• 1.2.3 tdh基因調(diào)控的研究現(xiàn)狀17-19
• 1.3 細(xì)菌基因敲除的研究現(xiàn)狀19-20
• 1.3 研究的目的和意義20
• 1.4 主要研究內(nèi)容20-22
• 第二章 副溶血弧菌tdh2敲除株和回補(bǔ)株的構(gòu)建22-37
• 2.1 引言22
• 2.2 試驗(yàn)材料22-24
• 2.2.1 菌株和質(zhì)粒22
• 2.2.2 主要試劑（盒）22-23
• 2.2.3 主要儀器23
• 2.2.4 引物23-24
• 2.3 試驗(yàn)方法24-30
• 2.3.1 菌種制備與保存24
• 2.3.2 副溶血弧菌tdh2敲除株的構(gòu)建24-28
• 2.3.3 副溶血弧菌tdh2回補(bǔ)株的構(gòu)建28-30
• 2.4 結(jié)果與分析30-36
• 2.4.1 副溶血弧菌tdh2敲除株的鑒定30-34
• 2.4.2 副溶血弧菌tdh2回補(bǔ)株的鑒定34-36
• 2.5 小結(jié)與討論36-37
• 第三章 副溶血弧菌tdh2敲除株生物學(xué)特性研究37-50
• 3.1 引言37
• 3.2 試驗(yàn)材料37-38
• 3.2.1 副溶血弧菌樣品37
• 3.2.2 主要試劑37-38
• 3.2.3 主要儀器38
• 3.3 試驗(yàn)方法38-42
• 3.3.1 溶血活性的測定38-39
• 3.3.2 生長曲線和活菌數(shù)的測定39
• 3.3.3 菌體及上清蛋白SDS-PAGE電泳39-41
• 3.3.4 藥敏試驗(yàn)41
• 3.3.5 耐酸試驗(yàn)41
• 3.3.6 耐膽汁試驗(yàn)41-42
• 3.4 結(jié)果與分析42-48
• 3.4.1 溶血活性比較42-43
• 3.4.2 生長曲線和活菌數(shù)比較43-44
• 3.4.3 蛋白SDS-PAGE電泳分析44-45
• 3.4.4 藥敏性比較45
• 3.4.5 耐酸性比較45-46
• 3.4.6 耐膽汁能力比較46-48
• 3.5 小結(jié)與討論48-50
• 第四章 副溶血弧菌TDH的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制研究50-62
• 4.1 引言50
• 4.2 試驗(yàn)材料50-52
• 4.2.1 菌株50
• 4.2.2 主要試劑50-51
• 4.2.3 主要儀器51
• 4.2.4 引物51-52
• 4.3 試驗(yàn)方法52-55
• 4.3.1 TDH的原核表達(dá)52-54
• 4.3.2 RT-PCR檢測相關(guān)調(diào)控子的基因表達(dá)54-55
• 4.4 結(jié)果與分析55-60
• 4.4.1 TDH原核表達(dá)結(jié)果與分析55-57
• 4.4.2 RT-PCR檢測結(jié)果與分析57-60
• 4.5 小結(jié)與討論60-62
• 第五章 結(jié)論與展望62-64
• 5.1 主要結(jié)論62
• 5.2 展望62-64
• 致謝64-65
• 參考文獻(xiàn)65-73
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文及其他科研成果73

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