本文關(guān)鍵詞：大熊貓犬瘟熱病毒H、F基因重組山羊痘病毒的構(gòu)建和鑒定

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【摘要】：犬瘟熱(Canine Distemper,CD)是由犬瘟熱病毒(Canine Distemper Virus,CDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病。CDV的感染呈世界性分布,并且可以在不同的物種間進(jìn)行傳播,除感染犬科外,浣熊科、大靈貓科以及貓科的部分成員均易感,動(dòng)物感染CDV后,表現(xiàn)多樣的臨床癥狀,且容易繼發(fā)其他病原微生物的感染,部分野生動(dòng)物如小熊貓死亡率高達(dá)100%。近年來,隨著CDV的不斷變異和進(jìn)化,CD的宿主范圍不斷地?cái)U(kuò)大,已經(jīng)有大熊貓、小熊貓、虎以及獅等野生動(dòng)物感染CDV的報(bào)道。目前,寵物犬瘟熱的預(yù)防主要依靠傳統(tǒng)的弱毒疫苗,雖然某些野生動(dòng)物使用寵物傳統(tǒng)的弱毒疫苗在控制CDV上有一定作用,但對(duì)于大熊貓、小熊貓、黑蹄臭鼬等野生動(dòng)物而言,其安全性和免疫效果均有很大的不足。因此,為了解決野生動(dòng)物CD的免疫預(yù)防的問題,同時(shí)解決寵物弱毒疫苗毒力可能返強(qiáng)等問題,開發(fā)和研制更加安全、高效的新型犬瘟熱活載體疫苗具有重要的意義。CDV是副黏病毒科、麻疹病毒屬成員,CDV囊膜表面的血凝素蛋白(H)與融合蛋白(F)是誘導(dǎo)中和抗體的主要抗原。由于山羊痘病毒(Goatpox Virus)存在復(fù)制缺陷性,故在哺乳動(dòng)物中為一過性感染,具有宿主限制性,安全性很高。因此山羊痘病毒是構(gòu)建表達(dá)犬瘟熱H與F基因重組疫苗的理想載體。本研究參照GenBank上已公布的大熊貓CDV H與F編碼的基因序列,對(duì)其抗原保守結(jié)構(gòu)和識(shí)別區(qū)域進(jìn)行修飾,由北京六合華大基因公司合成,在已有pMDTK-PEL-EGFP載體的基礎(chǔ)上,將CDV保護(hù)性抗原H、F基因分別克隆到pMDTK-pEL載體中,然后運(yùn)用酶切、連接將表達(dá)盒PELH、PELF分別構(gòu)建到pTK-Eg載體中,從而獲得重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pTK-H-Eg與pTK-F-Eg。分別將重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg與GTPV AV41株共轉(zhuǎn)染倉鼠腎細(xì)胞(BHK細(xì)胞),使其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組,獲得重組CDV的H、F基因的山羊痘病毒,然后在非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)上加壓篩選,利用gpt培養(yǎng)基篩選到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的重組病毒。通過PCR、綠色熒光以及Western blot鑒定,證明CDV的H、F基因成功構(gòu)建到GTPV基因組中,并且在細(xì)胞中均獲得了正確表達(dá),將獲得的重組病毒分別命名為vpTK-H-Eg與vpTK-F-Eg。這些工作為犬瘟熱基因重組疫苗研制打下了初步的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：重組山羊痘病毒 同源重組 犬瘟熱病毒 H基因 F基因
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-5
• 英文縮寫對(duì)照表5-11
• 前言11-20
• 1 犬瘟熱病毒概述11-19
• 1.1 犬瘟熱病毒的分子生物學(xué)特征11-13
• 1.1.1 CDV的分類與形態(tài)結(jié)構(gòu)11-12
• 1.1.2 CDV基因組結(jié)構(gòu)與功能12-13
• 1.1.2.1 融合蛋白（F）12-13
• 1.1.2.2 附著或血凝蛋白（H）13
• 1.1.2.3 核衣殼蛋白（N）13
• 1.1.2.4 其他結(jié)構(gòu)與非結(jié)構(gòu)蛋白13
• 1.2 犬瘟熱的流行病學(xué)13-14
• 1.3 犬瘟熱的致病機(jī)理14
• 1.4 犬瘟熱的臨床癥狀與病理變化14-15
• 1.5 犬瘟熱的診斷方法15
• 1.5.1 病毒的分離15
• 1.5.2 抗原檢測15
• 1.5.3 病毒核酸的檢測15
• 1.5.4 血清學(xué)診斷15
• 1.6 犬瘟熱的預(yù)防與控制15
• 1.7 犬瘟熱疫苗的研究進(jìn)展15-17
• 1.7.1 亞單位疫苗16
• 1.7.2 DNA疫苗16-17
• 1.7.3 重組活載體疫苗17
• 1.8 山羊痘病毒載體研究進(jìn)展17-19
• 1.8.1 GTPV的基本特征17-18
• 1.8.2 GTPV的基因組18
• 1.8.3 GTPV載體的構(gòu)建技術(shù)18-19
• 1.9 GTPV載體的應(yīng)用19
• 2 研究目的和意義19-20
• 第一章 犬瘟熱重組山羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體pTK-H-Eg與pTK-F-Eg構(gòu)建與鑒定20-40
• 1 引言20
• 2 材料與方法20-34
• 2.1 材料20-21
• 2.1.1 質(zhì)粒20
• 2.1.2 試劑和試劑盒20
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備20-21
• 2.2 方法21-34
• 2.2.1 主要試劑的配制21
• 2.2.2 基因的合成21-22
• 2.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成22
• 2.2.4 轉(zhuǎn)移載體骨架的pMDTK-PEL的構(gòu)建22-26
• 2.2.4.1 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pMDTK-PEL-EGFP酶切與回收22-23
• 2.2.4.2 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pMDTK-PEL-EGFP補(bǔ)平與回收23-24
• 2.2.4.3 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pMDTK-PEL-EGFP補(bǔ)平后的酶切與回收24
• 2.2.4.4 轉(zhuǎn)移載體pMDTK-PEL的自身環(huán)化連接24-25
• 2.2.4.5 DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備25
• 2.2.4.6 連接產(chǎn)物pMDTK-PEL轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞25-26
• 2.2.4.7 重組質(zhì)粒pMDTK-PEL的小量抽提26
• 2.2.4.8 重組質(zhì)粒pMDTK-PEL的序列測定26
• 2.2.5 重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pMDTK-PELH與pMDTK-PELF的構(gòu)建26-28
• 2.2.5.1 目的基因H、F與載體pMDTK-PEL連接28
• 2.2.5.2 連接產(chǎn)物pMDTK-PELH與pMDTK-PELF轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞28
• 2.2.5.3 重組質(zhì)粒pMDTK-PELH與pMDTK-PELF的小量抽提28
• 2.2.5.4 重組質(zhì)粒pMDTK-PELH與pMDTK-PELF的序列測定28
• 2.2.6 重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg的構(gòu)建28-34
• 2.2.6.1 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pMDTK-PELH酶切與回收28-29
• 2.2.6.2 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pMDTK-PELH補(bǔ)平與回收29
• 2.2.6.3 表達(dá)盒PELH的獲得29-30
• 2.2.6.4 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pMDTK-PELF酶切與回收30
• 2.2.6.5 轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pMDTK-PELF補(bǔ)平與回收30
• 2.2.6.6 表達(dá)盒PELF的獲得30-31
• 2.2.6.7 表達(dá)盒PELH、PELF與載體pTK-Eg連接31
• 2.2.6.8 連接產(chǎn)物pTK-H-Eg和pTK-F-Eg轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞31
• 2.2.6.9 重組質(zhì)粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg的小量抽提31
• 2.2.6.10 重組質(zhì)粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg的序列測定31-34
• 3 結(jié)果與分析34-38
• 3.1 載體質(zhì)粒pMDTK-PEL的構(gòu)建結(jié)果34
• 3.2 重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pMDTK-PELH與pMDTK-PELF的構(gòu)建結(jié)果34-35
• 3.3 重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pTK-H-Eg與pTK-F-Eg的構(gòu)建結(jié)果35-38
• 4 討論38-40
• 4.1 目的基因H、F的選擇38
• 4.2 重組山羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建38-40
• 第二章 犬瘟熱病毒H、F基因重組山羊痘病毒的構(gòu)建與鑒定40-54
• 1 引言40
• 2 材料與方法40-48
• 2.1 材料40-41
• 2.1.1 細(xì)胞和毒株40
• 2.1.2 試劑和試劑盒40-41
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備41
• 2.2 方法41-48
• 2.2.1 常用試劑溶液的配制41-42
• 2.2.2 SDS-PAGE和Western blot所需的試劑和溶液42
• 2.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成42-43
• 2.2.4 無內(nèi)毒素重組質(zhì)粒pTK-H-Eg和pTK-F-Eg的中量制備43
• 2.2.5 Vero、BHK細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代及凍存43-44
• 2.2.6 原代犢牛睪丸（bovine testicle，BT）細(xì)胞的制備44-45
• 2.2.7 山羊痘病毒GTPV AV41的增殖及滴度的測定45
• 2.2.8 重組GTPV的制備、純化和鑒定45-47
• 2.2.8.1 同源重組45-46
• 2.2.8.2 重組病毒的加壓篩選和純化46-47
• 2.2.9 重組病毒vpTK-H-Eg與vpTK-F-Eg的Western blot鑒定47-48
• 3 結(jié)果與分析48-52
• 3.1 GTPV AV41滴度的測定結(jié)果48
• 3.2 重組病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg的制備結(jié)果48-49
• 3.3 重組病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg純化的結(jié)果49-50
• 3.4 重組病毒vpTK-H-Eg和vpTK-F-Eg鑒定的結(jié)果50-51
• 3.5 重組病毒vpTK-H-Eg與vpTK-F-Eg的Western blot結(jié)果51-52
• 4 討論52-54
• 4.1 山羊痘病毒活載體的選擇52-53
• 4.2 重組山羊痘病毒的構(gòu)建與鑒定53
• 4.3 表達(dá)產(chǎn)物的檢測53-54
• 全文總結(jié)54-55
• 致謝55-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 附錄61-65

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本文編號(hào)：545450