發(fā)布時間：2017-07-04 05:09

  本文關(guān)鍵詞：牛支原體丙酮酸脫氫酶E1亞基基因的克隆、原核表達及α亞基單克隆抗體的制備

  更多相關(guān)文章： 牛支原體 丙酮酸脫氫酶E1 序列分析 亞細胞定位 單克隆抗體

【摘要】：牛支原體(Mycoplasma bovis)是牛的一種重要致病性支原體,可導(dǎo)致牛肺炎、乳房炎等一系列疾病。丙酮酸脫氫酶E1是生命體進行糖酵解的關(guān)鍵酶,而目前牛支原體丙酮酸脫氫酶E1的生物學功能研究,以及其是否可以作為牛支原體病診斷靶標的報道并不多見。本論文開展了牛支原體丙酮酸脫氫酶E1的克隆表達、單克隆抗體制備及其初步的生物學功能研究。本研究以PCR擴增獲得pdhα和pdhβ基因,應(yīng)用生物信息學軟件對pdhα和pdhβ基因序列進行初步分析;構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-pdhα和pET-pdhβ,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達重組融合蛋白,應(yīng)用Western blot及ELISA對E1?亞基和E1β亞基在細胞內(nèi)的分布進行了初步研究;重組融合蛋白rPDHA免疫小鼠制備免疫脾細胞,與小鼠骨髓瘤細胞融合,間接ELISA檢測能分泌預(yù)定抗體的陽性雜交瘤細胞并進行亞克隆篩選,同時對單克隆抗體的效價和反應(yīng)特異性進行檢測;利用帶有GFP標簽的E.coli-pdhα-gfp、E.coli-pdhβ-gfp表達菌感染NBL-4細胞,置于熒光顯微鏡觀察黏附情況。結(jié)果顯示:①pdhα與pdhβ基因序列與其他已報道的相關(guān)序列具有較高的相似性,E1α亞基和E1β亞基的表面可及性與抗原指數(shù)均較高;②pdhα與pdhβ基因在大腸桿菌中均成功表達,且均有良好的免疫原性,且Western blot及ELISA結(jié)果證實E1?和E1β在牛支原體細胞膜上和胞漿中均有分布且分布量相當;③篩選的2株單克隆抗體A12、B11的細胞上清效價為1:3 200左右,與牛支原體武威株及臨洮株的反應(yīng)特異性良好;④E.coli-pdhα-gfp、E.coli-pdhβ-gfp表達菌對NBL-4細胞有良好的黏附作用,其黏附作用可分別被抗rPDHA及rPDHB的多抗血清抑制,但E.coli-gfp表達菌對NBL-4細胞無黏附作用。研究結(jié)果表明,丙酮酸脫氫酶E1亞基可被呈遞至牛支原體細胞膜,并具有一定的黏附特性,為深入研究牛支原體的致病機制奠定基礎(chǔ);E1α亞基單克隆抗體的制備可為進一步開發(fā)牛支原體診斷治療相關(guān)產(chǎn)品提供參考資料。
【關(guān)鍵詞】：牛支原體 丙酮酸脫氫酶E1 序列分析 亞細胞定位 單克隆抗體
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.62
【目錄】：

• 摘要3-4
• Summary4-6
• 外文縮略語表6-10
• 第一章 文獻綜述10-16
• 1 牛支原體及其致病機理和診斷研究進展10-12
• 1.1 牛支原體10
• 1.2 牛支原體致病機理10-11
• 1.3 牛支原體相關(guān)疾病的診斷11-12
• 1.3.1 病原學診斷11
• 1.3.2 血清學診斷11
• 1.3.3 分子生物學診斷11-12
• 2 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體及其生物學功能12-14
• 2.1 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)組成12
• 2.2 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的催化作用機理12-13
• 2.3 丙酮酸脫氫酶E1的結(jié)構(gòu)及功能特性13-14
• 2.4 丙酮酸脫氫酶在支原體的相關(guān)研究14
• 4 本研究的目的意義14-16
• 第二章 牛支原體PDH E1亞基基因的克隆及相關(guān)信息分析16-24
• 1 材料16-18
• 1.1 菌種及載體16
• 1.2 儀器16
• 1.3 試劑16-18
• 1.3.1 主要試劑16-17
• 1.3.2 試劑配制17
• 1.3.3 培養(yǎng)基配制17-18
• 2 方法18-20
• 2.1 牛支原體基因組的粗提18
• 2.2 pdhα 和pdhβ 基因的擴增及優(yōu)化18-19
• 2.3 目的基因序列相似性及抗原表位初步預(yù)測19-20
• 3 結(jié)果20-23
• 3.1 pdhα 和pdhβ 基因的擴增及序列分析20-21
• 3.2 pdhα 和pdhβ 基因序列相似性分析結(jié)果21-22
• 3.3 E1α、E1β 亞基抗原表位初步預(yù)測結(jié)果22-23
• 4 討論23-24
• 第三章 牛支原體PDH E1亞基基因原核表達及亞細胞定位24-32
• 1 材料24-26
• 1.1 菌種、載體及試驗動物24
• 1.2 儀器24
• 1.3 試劑24-26
• 1.3.1 主要試劑24-25
• 1.3.2 試劑配制25-26
• 2 方法26-27
• 2.1 原核表達載體的構(gòu)建26
• 2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE分析26
• 2.3 多克隆抗體的制備26
• 2.4 膜蛋白提取26
• 2.5 E1a、β 亞基在牛支原體細胞內(nèi)的分布26-27
• 2.5.1 Western-blot分析27
• 2.5.2 ELISA檢測27
• 3 結(jié)果27-29
• 3.1 原核表達質(zhì)粒p ET-pdhα、p ET-pdhβ 的酶切鑒定27-28
• 3.2 r PDHA及r PDHB的誘導(dǎo)表達28
• 3.3 E1a、β 亞基在牛支原體細胞內(nèi)的分布28-29
• 4 討論29-32
• 第四章 牛支原體丙酮酸脫氫酶E1α 亞基單克隆抗體的制備32-41
• 1 材料32-33
• 1.1 試驗動物、菌株、細胞及抗原32
• 1.2 儀器32-33
• 1.3 主要試劑33
• 2 方法33-37
• 2.1 BALB/c小鼠的免疫33
• 2.2 骨髓瘤細胞的培養(yǎng)33
• 2.3 飼養(yǎng)細胞的制備33-34
• 2.4 小鼠免疫脾細胞的制備34-35
• 2.5 確定最佳抗原包被量35
• 2.6 骨髓瘤細胞和免疫脾細胞的融合35
• 2.7 雜交瘤細胞的抗體檢測35-36
• 2.8 陽性雜交瘤細胞亞克隆篩選36
• 2.9 雜交瘤細胞的凍存與復(fù)蘇36-37
• 2.10 單克隆抗體效價檢測37
• 2.11 單克隆抗體特異性檢測37
• 2.12 雜交瘤細胞分泌抗體穩(wěn)定性檢測37
• 3 結(jié)果37-40
• 3.1 牛支原體抗原最佳包被濃度的確定37-38
• 3.2 細胞融合前小鼠尾血效價38
• 3.3 雜交瘤細胞株的建立38
• 3.4 單克隆抗體的生物學活性38-39
• 3.4.1 單克隆抗體效價38-39
• 3.4.2 單克隆抗體特異性39
• 3.5 雜交瘤細胞分泌抗體穩(wěn)定性檢測39-40
• 4 討論40-41
• 第五章 牛支原體丙酮酸脫氫酶E1亞基的黏附特性研究41-47
• 1 材料41-42
• 1.1 菌株、載體與細胞41
• 1.2 試劑41-42
• 2 方法42-43
• 2.1 熒光表達載體的構(gòu)建42
• 2.2 重組菌的誘導(dǎo)表達42
• 2.3 E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp對NBL-4 細胞的黏附試驗42
• 2.4 E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp對NBL-4 細胞的黏附抑制試驗42-43
• 3 結(jié)果43-45
• 3.1 重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定43
• 3.2 重組菌的誘導(dǎo)表達43-44
• 3.3 E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp對NBL-4 細胞的黏附試驗44
• 3.4 多抗血清對E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp的黏附抑制試驗44-45
• 4 討論45-47
• 全文結(jié)論47-48
• 參考文獻48-54
• 致謝54-55
• 作者簡介55-56
• 導(dǎo)師簡介56-58

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 邵國青;我國主要動物支原體病研究述略與展望[J];畜牧與獸醫(yī);2000年02期

2 王爽;;雞支原體病的治療[J];黑龍江科技信息;2011年31期

3 孔令聰;張春艷;高云航;馬紅霞;;牛支原體耐藥性研究進展[J];中國獸藥雜志;2013年09期

4 賀慕嚴;;支原體簡介[J];生物學通報;1984年04期

5 寧宜寶;動物支原體病預(yù)防與控制的研究進展[J];中國獸藥雜志;1999年01期

6 惠臨風;張龍有;;雞支原體病的防治[J];科技致富向?qū)?2000年07期

7 李玉華;李紅;;肺支原體研究進展[J];中國比較醫(yī)學雜志;2007年07期

8 嚴麗華;袁聰俐;朱凝瑜;華修國;;嗜血支原體(附紅細胞體)病原學研究進展[J];上海交通大學學報(農(nóng)業(yè)科學版);2009年02期

9 邵國青;;家禽支原體的防控現(xiàn)狀及研究新進展[J];中國家禽;2009年11期

10 鮑興智;嚴軍;;綿羊肺炎支原體的研究進展[J];青海畜牧獸醫(yī)雜志;2009年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 糜祖煌;秦玲;;五種支原體聯(lián)合分子檢測在支原體病診斷中的應(yīng)用[A];第五屆全國優(yōu)生科學大會論文匯編[C];2000年

2 謝海剛;溫敬娟;;雞支原體病的診斷與防治[A];“科技支撐高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、生態(tài)、安全現(xiàn)代畜牧業(yè)”論文集[C];2012年

3 韓瀟瀟;陳穎鈺;郭愛珍;;牛支原體相關(guān)疾病綜合防治措施[A];第四屆全國牛病防制及產(chǎn)業(yè)發(fā)展大會論文集[C];2012年

4 王金玲;丁玉林;李平安;黃海碧;馮超;吳建美;王鳳龍;;犢牛支原體性關(guān)節(jié)炎的診斷[A];2012年中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會暨中國病理生理學會動物病理生理專業(yè)委員會學術(shù)研討會論文集[C];2012年

5 張秀美;M.I.Khan;;PCR技術(shù)在禽支原體診斷上的發(fā)展和應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會禽病學分會第十一次學術(shù)研討會論文集[C];2002年

6 邵國青;;我國主要動物支原體病研究述略[A];面向21世紀的科技進步與社會經(jīng)濟發(fā)展（下冊）[C];1999年

7 胡長敏;石磊;龔瑞;白智迪;郭愛珍;;牛支原體病研究進展[A];中國奶業(yè)協(xié)會第24次繁殖學術(shù)年會暨國家奶牛/肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系第一屆全國牛病防治學術(shù)研討會論文集[C];2009年

8 郭夢堯;王國卿;張乃生;楊正濤;劉文博;;病死犢牛呼吸系統(tǒng)內(nèi)支原體的分離與鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2010年學術(shù)年會——第二屆中國獸醫(yī)臨床大會論文集(上冊)[C];2010年

9 張秀美;;PCR技術(shù)在禽支原體診斷上的發(fā)展和應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會成立20周年慶典暨第十次學術(shù)研討會論文集（下）[C];2003年

10 常繼濤;于力;;Leachii支原體病的研究現(xiàn)狀與展望[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學術(shù)研討會論文集[C];2013年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 ;支原體特效合劑[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2001年

2 寧夏多維泰瑞制藥有限公司;雞支原體病的防制[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2001年

3 寧夏多維泰瑞制藥有限公司;禽呼吸道支原體病[N];中國畜牧報;2002年

4 林立;鷓鴣支原體病的防治[N];山西科技報;2001年

5 寧夏多維泰瑞制藥有限公司;禽呼吸道支原體病[N];中國畜牧報;2002年

6 朱其太 連云港出入境檢驗檢疫局;雞支原體病的預(yù)防和治療[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2001年

7 ;雞支原體病的防制[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2001年

8 寧夏多維泰瑞制藥有限公司;雞支原體病的防治[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2001年

9 寧夏多維泰瑞制藥有限公司;禽呼吸道支原體病[N];中國畜牧報;2002年

10 楊博;冬季雞支原體病咋防治[N];山西科技報;2002年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 袁聰俐;豬嗜血支原體病原特性、流行特點及與宿主互作機制研究[D];上海交通大學;2009年

2 郭子晟;鴨和鴿支原體基因組測序及比較基因組學分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2011年

3 魏順;衣阿華支原體與滑液支原體的全基因組測序及分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2012年

4 李佳禾;牛支原體表達載體的構(gòu)建[D];中國農(nóng)業(yè)大學;2015年

5 張秀英;單諾沙星在健康和支原體-大腸桿菌感染雞的藥動學與藥效學研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2001年

6 徐春光;絲狀支原體PG3株和綿羊肺炎支原體內(nèi)蒙分離株基因組測序及可變表面脂蛋白基因克隆表達[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊銘偉;牛支原體滅活疫苗的研制與免疫效果研究[D];石河子大學;2015年

2 胡國明;基于脂蛋白P48的牛支原體快速檢測方法的建立[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學;2015年

3 王永威;豬嗜血支原體SYBR Green qPCR檢測方法的建立及應(yīng)用[D];山西農(nóng)業(yè)大學;2015年

4 李娜;牛支原體二氫硫辛酸脫氫酶基因的克隆表達及缺失株的構(gòu)建[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學;2016年

5 蘇煒德;牛支原體丙酮酸脫氫酶E1亞基基因的克隆、原核表達及α亞基單克隆抗體的制備[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學;2016年

6 范媛;牛支原體生長特性及其致病性研究[D];西南大學;2011年

7 孫文靜;牛支原體硫辛酰胺脫氫酶的蛋白質(zhì)組學篩選及其功能鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2012年

8 蔣勇;牛支原體免疫原性研究[D];西南大學;2013年

9 嚴麗華;脈沖場電泳鑒定豬嗜血支原體基因組的研究[D];上海交通大學;2009年

10 李大偉;牛支原體PCR診斷方法的建立及流行病學調(diào)查[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2011年

，

本文編號：516437