本文關(guān)鍵詞：牛支原體丙酮酸脫氫酶E1亞基基因的克隆、原核表達(dá)及α亞基單克隆抗體的制備

  更多相關(guān)文章： 牛支原體 丙酮酸脫氫酶E1 序列分析 亞細(xì)胞定位 單克隆抗體

【摘要】：牛支原體(Mycoplasma bovis)是牛的一種重要致病性支原體,可導(dǎo)致牛肺炎、乳房炎等一系列疾病。丙酮酸脫氫酶E1是生命體進(jìn)行糖酵解的關(guān)鍵酶,而目前牛支原體丙酮酸脫氫酶E1的生物學(xué)功能研究,以及其是否可以作為牛支原體病診斷靶標(biāo)的報道并不多見。本論文開展了牛支原體丙酮酸脫氫酶E1的克隆表達(dá)、單克隆抗體制備及其初步的生物學(xué)功能研究。本研究以PCR擴(kuò)增獲得pdhα和pdhβ基因,應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對pdhα和pdhβ基因序列進(jìn)行初步分析;構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-pdhα和pET-pdhβ,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白,應(yīng)用Western blot及ELISA對E1?亞基和E1β亞基在細(xì)胞內(nèi)的分布進(jìn)行了初步研究;重組融合蛋白rPDHA免疫小鼠制備免疫脾細(xì)胞,與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合,間接ELISA檢測能分泌預(yù)定抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞并進(jìn)行亞克隆篩選,同時對單克隆抗體的效價和反應(yīng)特異性進(jìn)行檢測;利用帶有GFP標(biāo)簽的E.coli-pdhα-gfp、E.coli-pdhβ-gfp表達(dá)菌感染NBL-4細(xì)胞,置于熒光顯微鏡觀察黏附情況。結(jié)果顯示:①pdhα與pdhβ基因序列與其他已報道的相關(guān)序列具有較高的相似性,E1α亞基和E1β亞基的表面可及性與抗原指數(shù)均較高;②pdhα與pdhβ基因在大腸桿菌中均成功表達(dá),且均有良好的免疫原性,且Western blot及ELISA結(jié)果證實E1?和E1β在牛支原體細(xì)胞膜上和胞漿中均有分布且分布量相當(dāng);③篩選的2株單克隆抗體A12、B11的細(xì)胞上清效價為1:3 200左右,與牛支原體武威株及臨洮株的反應(yīng)特異性良好;④E.coli-pdhα-gfp、E.coli-pdhβ-gfp表達(dá)菌對NBL-4細(xì)胞有良好的黏附作用,其黏附作用可分別被抗rPDHA及rPDHB的多抗血清抑制,但E.coli-gfp表達(dá)菌對NBL-4細(xì)胞無黏附作用。研究結(jié)果表明,丙酮酸脫氫酶E1亞基可被呈遞至牛支原體細(xì)胞膜,并具有一定的黏附特性,為深入研究牛支原體的致病機制奠定基礎(chǔ);E1α亞基單克隆抗體的制備可為進(jìn)一步開發(fā)牛支原體診斷治療相關(guān)產(chǎn)品提供參考資料。
【關(guān)鍵詞】：牛支原體 丙酮酸脫氫酶E1 序列分析 亞細(xì)胞定位 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.62
【目錄】：

• 摘要3-4
• Summary4-6
• 外文縮略語表6-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-16
• 1 牛支原體及其致病機理和診斷研究進(jìn)展10-12
• 1.1 牛支原體10
• 1.2 牛支原體致病機理10-11
• 1.3 牛支原體相關(guān)疾病的診斷11-12
• 1.3.1 病原學(xué)診斷11
• 1.3.2 血清學(xué)診斷11
• 1.3.3 分子生物學(xué)診斷11-12
• 2 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體及其生物學(xué)功能12-14
• 2.1 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)組成12
• 2.2 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的催化作用機理12-13
• 2.3 丙酮酸脫氫酶E1的結(jié)構(gòu)及功能特性13-14
• 2.4 丙酮酸脫氫酶在支原體的相關(guān)研究14
• 4 本研究的目的意義14-16
• 第二章 牛支原體PDH E1亞基基因的克隆及相關(guān)信息分析16-24
• 1 材料16-18
• 1.1 菌種及載體16
• 1.2 儀器16
• 1.3 試劑16-18
• 1.3.1 主要試劑16-17
• 1.3.2 試劑配制17
• 1.3.3 培養(yǎng)基配制17-18
• 2 方法18-20
• 2.1 牛支原體基因組的粗提18
• 2.2 pdhα 和pdhβ 基因的擴(kuò)增及優(yōu)化18-19
• 2.3 目的基因序列相似性及抗原表位初步預(yù)測19-20
• 3 結(jié)果20-23
• 3.1 pdhα 和pdhβ 基因的擴(kuò)增及序列分析20-21
• 3.2 pdhα 和pdhβ 基因序列相似性分析結(jié)果21-22
• 3.3 E1α、E1β 亞基抗原表位初步預(yù)測結(jié)果22-23
• 4 討論23-24
• 第三章 牛支原體PDH E1亞基基因原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位24-32
• 1 材料24-26
• 1.1 菌種、載體及試驗動物24
• 1.2 儀器24
• 1.3 試劑24-26
• 1.3.1 主要試劑24-25
• 1.3.2 試劑配制25-26
• 2 方法26-27
• 2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建26
• 2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析26
• 2.3 多克隆抗體的制備26
• 2.4 膜蛋白提取26
• 2.5 E1a、β 亞基在牛支原體細(xì)胞內(nèi)的分布26-27
• 2.5.1 Western-blot分析27
• 2.5.2 ELISA檢測27
• 3 結(jié)果27-29
• 3.1 原核表達(dá)質(zhì)粒p ET-pdhα、p ET-pdhβ 的酶切鑒定27-28
• 3.2 r PDHA及r PDHB的誘導(dǎo)表達(dá)28
• 3.3 E1a、β 亞基在牛支原體細(xì)胞內(nèi)的分布28-29
• 4 討論29-32
• 第四章 牛支原體丙酮酸脫氫酶E1α 亞基單克隆抗體的制備32-41
• 1 材料32-33
• 1.1 試驗動物、菌株、細(xì)胞及抗原32
• 1.2 儀器32-33
• 1.3 主要試劑33
• 2 方法33-37
• 2.1 BALB/c小鼠的免疫33
• 2.2 骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)33
• 2.3 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備33-34
• 2.4 小鼠免疫脾細(xì)胞的制備34-35
• 2.5 確定最佳抗原包被量35
• 2.6 骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞的融合35
• 2.7 雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測35-36
• 2.8 陽性雜交瘤細(xì)胞亞克隆篩選36
• 2.9 雜交瘤細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇36-37
• 2.10 單克隆抗體效價檢測37
• 2.11 單克隆抗體特異性檢測37
• 2.12 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定性檢測37
• 3 結(jié)果37-40
• 3.1 牛支原體抗原最佳包被濃度的確定37-38
• 3.2 細(xì)胞融合前小鼠尾血效價38
• 3.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立38
• 3.4 單克隆抗體的生物學(xué)活性38-39
• 3.4.1 單克隆抗體效價38-39
• 3.4.2 單克隆抗體特異性39
• 3.5 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定性檢測39-40
• 4 討論40-41
• 第五章 牛支原體丙酮酸脫氫酶E1亞基的黏附特性研究41-47
• 1 材料41-42
• 1.1 菌株、載體與細(xì)胞41
• 1.2 試劑41-42
• 2 方法42-43
• 2.1 熒光表達(dá)載體的構(gòu)建42
• 2.2 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)42
• 2.3 E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp對NBL-4 細(xì)胞的黏附試驗42
• 2.4 E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp對NBL-4 細(xì)胞的黏附抑制試驗42-43
• 3 結(jié)果43-45
• 3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定43
• 3.2 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)43-44
• 3.3 E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp對NBL-4 細(xì)胞的黏附試驗44
• 3.4 多抗血清對E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp的黏附抑制試驗44-45
• 4 討論45-47
• 全文結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 致謝54-55
• 作者簡介55-56
• 導(dǎo)師簡介56-58

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