本文關(guān)鍵詞：鴨呼腸孤病毒基因Ⅰ型與Ⅱ型鑒別診斷RT-PCR方法的建立與應(yīng)用

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【摘要】：臨床發(fā)病鴨(Anas platyrhynchos domestica)群中存在兩種基因型鴨呼腸孤病毒(Duck reovirus,DRV)的感染。為建立一種能鑒別診斷DRVⅠ型(classical DRV,C-DRV)與Ⅱ型(novel DRV,N-DRV)的一步法RT-PCR檢測(cè)方法,本研究通過(guò)對(duì)Gen Bank已公布的現(xiàn)有C-DRV和N-DRV S1和S4基因片段序列進(jìn)行比對(duì)分析,設(shè)計(jì)合成兩對(duì)特異性引物,并對(duì)引物濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù)等擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化,建立一種能鑒別診斷C-DRV和N-DRV的一步法RT-PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明,一步法RT-PCR最佳的反應(yīng)體系為:Prime Script 1 Step Enzyme Mix 1μL,2×1 Step Buffer 12.5μL,RNA模板1.5μL,上下游引物(20μmol/L)各1μL,RNase Free d H_2O補(bǔ)足25μL;最佳反應(yīng)條件:50℃反轉(zhuǎn)錄30 min;94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán)。該方法可從C-DRV和N-DRV基因組中擴(kuò)增出大小分別為249和505 bp單一特異性片段,從兩種病毒基因組混合物中可同時(shí)擴(kuò)增出兩條特異性片段,而對(duì)鴨源常見(jiàn)病毒及正常細(xì)胞基因組在同等條件下檢測(cè)均為陰性;該方法具有較高的敏感性,其最低病毒檢出量分別為0.47和0.62個(gè)半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50%tissue culture infective dose,TCID50);對(duì)不同代次、不同時(shí)間提取的病毒RNA樣品重復(fù)檢驗(yàn)3次,結(jié)果均一致。對(duì)浙江省2011~2015年采集的239份疑似臨床病料進(jìn)行檢測(cè),C-DRV與N-DRV的陽(yáng)性率分別為2.5%(6/239)和31.4%(75/239);通過(guò)對(duì)陽(yáng)性病料P10和P18擴(kuò)增序列的測(cè)序也證實(shí)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究建立的雙重一步法RT-PCR可以有效區(qū)分兩種基因型DRV,且臨床樣品檢測(cè)表明N-DRV是浙江省流行的優(yōu)勢(shì)基因型。本研究為鑒別診斷CDRV與N-DRV提供了一個(gè)快速、靈敏性高及低成本的實(shí)驗(yàn)室診斷方法,該方法的建立可為DRV的分子流行病毒學(xué)調(diào)查提供有效的技術(shù)支持。
【作者單位】： 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所;
【關(guān)鍵詞】： 鴨呼腸孤病毒(DRV) 多重一步法RT-PCR 基因型
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31302124) 浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2015C02G4010058)
【分類號(hào)】：S852.65
【正文快照】： 鴨呼腸孤病毒(Duck reovirus,DRV)可以引起的番鴨(Cairna moschata)、北京鴨(Anas platyrhynchusdomesticus)、半番鴨(Cairina×Anas)和鵝(Anser domes-tica)等水禽的急性傳染病,1997以來(lái)在廣東、廣西、福建、浙江和江西等地流行廣泛(吳寶成等,2001;Wang et al.,2013;Yun et a

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