本文關鍵詞：6個家蠶抗病毒基因在家蠶感染BmNPV和BmBDV后轉錄水平研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：家蠶在中國有悠久的養(yǎng)殖歷史,它不僅擁有較高的經(jīng)濟價值,還能作為良好的模式生物擁有較高的科研價值。但是在家蠶的養(yǎng)殖過程中,家蠶容易受到多種因素的影響而造成損失。在我國,由家蠶核型多角體病毒(BmNPV)引起的病毒病占整個病毒病的很大部分,會對家蠶造成極大的危害。家蠶二分濃核病毒(Bm BDV)是二分DNA病毒科中第一個被發(fā)現(xiàn)的成員,具有典型性。通過熒光定量PCR方法,研究家蠶抗BmBDV品系798和感性品系306接種Bm BDV、抗BmNPV品系NB和感性品系華八(三五)接種BmNPV后一些免疫相關基因(bmi、argo、dicer、cap1、cap3和car)在家蠶中腸組織中的轉錄水平變化情況。結果發(fā)現(xiàn),雖然這些基因的轉錄水平在不同家蠶品系中差異很大,Bm BDV和BmNPV的感染對基因轉錄水平的影響也有所不同,但存在一個共同的趨勢,即病毒感染能夠負調控這些基因的轉錄水平。在相應病毒感染情況下,bmi和dicer在798和306中下調,在NB和華八(三五)中上調;argo和cap3在798和306中上調,在NB中上調,但在華八(三五)中下調;cap1在798和306中上調,在NB和華八(三五)中也上調;car在798中沒有明顯變化,在306中下調,在NB中上調,在華八(三五)中下調。這些發(fā)現(xiàn)為進一步研究這些基因在病毒感染增殖中的作用打下了良好的基礎。car基因是一個羧酸酯酶基因。以家蠶cDNA作為模版,利用PCR技術對car基因進行了克隆。將克隆得到的基因片段與克隆質粒相連進行擴增,將擴增后的片段與表達質粒相連并轉入BL21中,經(jīng)IPTG誘導表達目的蛋白,目的蛋白主要以包涵體方式存在,將目的蛋白變性后利用Ni-NTA對其純化。將經(jīng)純化的蛋白分為兩部分,一部分用作制備多克隆抗體,將另一部分復性來用作酶活測定。經(jīng)過4周對小鼠的免疫之后,成功地制備了多克隆抗體血清。經(jīng)酶活測定,發(fā)現(xiàn)在39℃時目的蛋白的酶活最高。利用熒光定量PCR的方法研究了car基因在家蠶不同生長階段和組織中的轉錄水平。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn),脂肪體中car基因的轉錄水平比其他所有組織中最高的都高,而在頭中的轉錄水平是最低的;car基因在蛹期的轉錄水平比其他生長階段都高。
【關鍵詞】：家蠶 抗病毒 羧酸酯酶
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S884.5;Q78
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-20
• 1.1. 家蠶及其抗病毒研究的概況11-14
• 1.1.1. 家蠶基因組的研究11
• 1.1.2. 家蠶抗病毒相關基因研究11-14
• 1.2. 家蠶核型多角體病毒（Bm NPV）14-16
• 1.2.1. 桿狀病毒分類14
• 1.2.2. 桿狀病毒生活史14-15
• 1.2.3. 桿狀病毒基因15-16
• 1.3. 家蠶二分濃核病毒（BmBDV）16-18
• 1.3.1. 家蠶二分濃核病毒基因組16
• 1.3.2. 家蠶二分濃核病毒的蛋白質組16-17
• 1.3.3. 家蠶二分濃核病毒的復制與表達17-18
• 1.4. 研究意義18
• 1.5. 主要研究內容和技術路線18-20
• 1.5.1. 主要研究內容18-19
• 1.5.2. 技術路線19-20
• 第二章 6個抗病毒度相關基因在家蠶抗病毒品系和易感病毒品系中的轉錄水平20-32
• 2.1. 材料與試劑20-21
• 2.1.1. 家蠶品種、桑葉和病毒20
• 2.1.2. 試劑盒20-21
• 2.1.3. 其他試劑21
• 2.1.4. 實驗儀器21
• 2.2. 實驗方法21-23
• 2.2.1. 家蠶的飼養(yǎng)及病毒接種方法21
• 2.2.2. RNA提取及c DNA合成21-22
• 2.2.3. 熒光定量PCR22-23
• 2.2.4. 數(shù)據(jù)處理23
• 2.3. 實驗結果23-28
• 2.3.1. 接種Bm BDV后家蠶體內6個基因的表達分析23-26
• 2.3.2. 接種Bm NPV后家蠶體內6個基因的表達分析26-28
• 2.4. 本章討論及小結28-32
• 第三章 car基因的原核表達、純化、多克隆抗體制備與酶活測定32-48
• 3.1 材料與試劑32-35
• 3.1.1 菌種、質粒和實驗小鼠32
• 3.1.2 工具酶和試劑盒32
• 3.1.3 其他試劑32-33
• 3.1.4 緩沖液33-34
• 3.1.5 培養(yǎng)基34
• 3.1.6 主要儀器34-35
• 3.2 實驗方法35-42
• 3.2.1 基因克隆35-36
• 3.2.2 構建克隆載體和表達載體36-38
• 3.2.3. 基因的原核表達38-40
• 3.2.4. 蛋白質的純化40-41
• 3.2.5. 酶活力測定41
• 3.2.6. 多克隆抗體制備及純化41-42
• 3.3. 實驗結果42-47
• 3.3.1. 基因克隆、克隆質粒構建和表達質粒構建42-43
• 3.3.2. 目的基因的原核表達43-44
• 3.3.3. 蛋白純化44-45
• 3.3.4. 酶活性測定45-46
• 3.3.5. 抗體驗證46-47
• 3.4. 本章討論與小結47-48
• 第四章 car基因時相轉錄水平表達分析48-53
• 4.1 材料與試劑48-49
• 4.1.1 實驗家蠶48
• 4.1.2 試劑盒48
• 4.1.3 其他試劑48
• 4.1.4 實驗儀器48-49
• 4.2 實驗方法49-50
• 4.2.1 家蠶飼養(yǎng)及解剖49
• 4.2.2 RNA提取及c DNA合成49
• 4.2.3 熒光定量PCR49-50
• 4.2.4 數(shù)據(jù)分析50
• 4.3. 實驗結果50-51
• 4.3.1. 羧酸酯酶基因在不同組織的表達分析50-51
• 4.3.2. 羧酸酯酶基因在不同發(fā)育階段的表達分析51
• 4.4. 本章討論及小結51-53
• 第五章 總結與展望53-55
• 5.1 總結53-54
• 5.2 展望54-55
• 參考文獻55-61
• 致謝61-62
• 在學期間發(fā)表的學術論文62-63
• 參與的主要課題63

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