本文關(guān)鍵詞：苦豆子抗鹽相關(guān)基因的篩選及功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：土壤鹽漬化是目前制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)全球性問(wèn)題,全球約有20%的耕地受到鹽害威脅,43%的耕地為干旱、半干旱地區(qū)。鹽害嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育,造成作物減產(chǎn),并使生態(tài)環(huán)境日益惡化。在自然條件下,由于環(huán)境脅迫而嚴(yán)重影響了作物生長(zhǎng)發(fā)育,其遺傳潛力難以發(fā)揮,鹽漬不僅影響了作物的產(chǎn)量,而且限制了植物的廣泛分布,因此,提高作物的耐鹽能力已成為抗逆育種急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物的耐鹽堿性,已在鹽堿土壤改良方面得到廣泛的應(yīng)用。同時(shí),以旱生、耐鹽堿植物為研究材料,從中分離克隆得到耐鹽堿性顯著的基因,是獲得抗性基因資源的有效方法�？喽棺�(Sophora alopecuroides)為豆科槐屬植物,別名、苦豆草、歐苦參等,為多年生草本、根莖地下芽旱生耐鹽植物。其耐旱、耐鹽性顯著,是一個(gè)抗性基因豐富的基因資源庫(kù)。本研究利用苦豆子c DNA酵母表達(dá)文庫(kù)對(duì)苦豆子抗鹽相關(guān)基因進(jìn)行篩選,并篩選到了2個(gè)抗鹽相關(guān)基因,苦豆子肌醇甲基轉(zhuǎn)移酶基因(Sa IMT)和苦豆子水通道蛋白基因(Sa AQP),同時(shí)對(duì)其結(jié)構(gòu)初步分析,并利用豆科模式轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)一步驗(yàn)證了該基因的抗鹽性。為后續(xù)抗逆育種奠定理論依據(jù)與物質(zhì)和技術(shù)基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下1以苦豆子在Na Cl鹽脅迫下的根為實(shí)驗(yàn)材料,利用SMART法構(gòu)建全長(zhǎng)c DNA文庫(kù),構(gòu)建完成的c DNA酵母表達(dá)文庫(kù)得到的總克隆數(shù)為2.3×107Cfu,文庫(kù)滴度為7.7×106Cfu/ml,插入片段長(zhǎng)度約在1.2kb-2.0kb之間,相關(guān)參數(shù)均符合表達(dá)文庫(kù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。2利用酵母植物抗逆篩選體系對(duì)苦豆子苗期根的c DNA酵母表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選,共篩選到16個(gè)抗鹽克隆,對(duì)這16個(gè)基因進(jìn)行測(cè)序及序列比對(duì)后,最終得到了2個(gè)抗鹽相關(guān)基因,分別是苦豆子肌醇甲基轉(zhuǎn)移酶基因(Sa IMT)和苦豆子水通道蛋白基因(Sa AQP)。Sa IMT開(kāi)放閱讀框?yàn)?095bp,編碼364個(gè)氨基酸;Sa AQP開(kāi)放閱讀框?yàn)?53bp,編碼250個(gè)氨基酸。3對(duì)篩選得到的Sa IMT和Sa AQP進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)Sa IMT與其他物種的IMTs蛋白、Sa AQP與其他物種的AQPs蛋白均有較高的同源性和較近的親緣關(guān)系,同時(shí)Sa IMT與大豆Gm IMT、Sa AQP和擬南芥At AQP在蛋白序列結(jié)構(gòu)域上均很保守,而二者的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)都非常相似,預(yù)示Sa IMT、Sa AQP與其同源基因有著相似的功能。4對(duì)Sa IMT和Sa AQP在苦豆子不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Sa IMT和Sa AQP在根中的表達(dá)量都顯著高于葉片和莖;對(duì)苦豆子幼苗進(jìn)行Na Cl鹽脅迫處理后,Sa IMT和Sa AQP基因的在脅迫初期表達(dá)都有明顯的升高。5將Sa IMT和Sa AQP利用豆科模式轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌K599,侵染大豆誘導(dǎo)發(fā)狀根,對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根和轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根植物復(fù)合體進(jìn)行Na Cl鹽脅迫處理,鑒定Sa IMT和Sa AQP的抗鹽性。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)Sa IMT和Sa AQP的大豆發(fā)狀根和大豆發(fā)狀根植物復(fù)合體的耐鹽性均明顯提高,說(shuō)明Sa IMT和Sa AQP能提高轉(zhuǎn)基因大豆的耐鹽性。
【關(guān)鍵詞】：苦豆子 cDNA文庫(kù) 發(fā)根農(nóng)桿菌 抗鹽性 功能分析
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-13
• 中英文做略語(yǔ)表13-14
• 第1章 緒論14-25
• 1.1 鹽害及植物耐鹽生理14-15
• 1.1.1 鹽對(duì)植物的危害14
• 1.1.2 植物耐鹽生理14-15
• 1.2 耐鹽基因的研究進(jìn)展15-18
• 1.2.1 植物根部在鹽脅迫下的基因調(diào)控15
• 1.2.2 Na+和K+的轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)15-16
• 1.2.3 Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX和SOS16-17
• 1.2.4 高親和K +轉(zhuǎn)運(yùn)載體17
• 1.2.5 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)17-18
• 1.3 肌醇甲基轉(zhuǎn)移酶的研究進(jìn)展18-19
• 1.3.1 松醇的生理作用18-19
• 1.3.2 松醇的合成途徑19
• 1.4 水通道蛋白的研究進(jìn)展19-21
• 1.4.1 水通道蛋白的分類19-20
• 1.4.2 水通道蛋白的生物學(xué)功能20
• 1.4.3 AQPs參與植物鹽脅迫應(yīng)答的途徑20-21
• 1.5 苦豆子研究進(jìn)展21-22
• 1.6 分子生物學(xué)研究方法22-23
• 1.6.1 cDNA文庫(kù)22-23
• 1.6.2 豆科模式轉(zhuǎn)化系統(tǒng)23
• 1.7 本研究的目的和意義23-25
• 第2章 苦豆子苗期酵母表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建及抗鹽基因的篩選25-41
• 2.1 材料25-26
• 2.1.1 植物材料25
• 2.1.2 菌株25
• 2.1.3 酶及試劑25
• 2.1.4 引物25
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備25-26
• 2.1.6 試劑配制26
• 2.2 方法26-33
• 2.2.1 植物材料的處理26-27
• 2.2.2 苦豆子葉片丙二醛（MDA）含量測(cè)定27
• 2.2.3 苦豆子葉片相對(duì)含水量（RWC）測(cè)定27-28
• 2.2.4 苦豆子總RNA的提取28
• 2.2.5 苦豆子苗期E.colicDNA文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)28-29
• 2.2.6 苦豆子苗期cDNA文庫(kù)質(zhì)粒提取29-30
• 2.2.7 釀酒酵母INVSC1感受態(tài)的制備30
• 2.2.8 文庫(kù)質(zhì)粒大規(guī)模轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSC1感受態(tài)細(xì)胞30-31
• 2.2.9 苦豆子苗期酵母表達(dá)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建31
• 2.2.10 酵母植物抗逆基因篩選體系篩選苦豆子抗鹽相關(guān)基因31-33
• 2.2.11 候選基因的生物信息學(xué)分析33
• 2.3 結(jié)果與分析33-39
• 2.3.1 苦豆子葉片丙二醛（MDA）含量測(cè)定33-34
• 2.3.2 苦豆子葉片相對(duì)含水量（RWC）測(cè)定34-35
• 2.3.3 苦豆子苗期E.colicDNA文庫(kù)重組率及插入片段長(zhǎng)度鑒定35-36
• 2.3.4 苦豆子苗期酵母表達(dá)cDNA文庫(kù)重組率及插入片段長(zhǎng)度鑒定36-37
• 2.3.5 篩選到苦豆子抗鹽相關(guān)基因的生物信息學(xué)分析37-39
• 2.4 討論39-40
• 2.5 小結(jié)40-41
• 第3章 SaIMT和SaAQP基因的生物信息學(xué)分析及表達(dá)模式分析41-57
• 3.1 材料41
• 3.1.1 植物材料41
• 3.1.2 酶及試劑41
• 3.1.3 引物41
• 3.1.4 主要儀器設(shè)備41
• 3.2 方法41-44
• 3.2.1 材料處理及取樣41-42
• 3.2.2 植物總RNA的提取42
• 3.2.3 cDNA的合成42-43
• 3.2.4 生物信息學(xué)分析43
• 3.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR43-44
• 3.3 結(jié)果44-55
• 3.3.1 SaIMT基因的生物信息學(xué)分析44-48
• 3.3.2 SaAQP基因的生物信息學(xué)分析48-52
• 3.3.3 SaIMT和SaAQP基因在苦豆子不同組織中的表達(dá)52-53
• 3.3.4 NaCl脅迫處理下苦豆子中SaIMT和SaAQP基因的表達(dá)53-55
• 3.4 討論55-56
• 3.5 小結(jié)56-57
• 第4章 SaIMT基因和SaAQP基因在大豆發(fā)狀根中的抗鹽性分析57-75
• 4.1 材料57-59
• 4.1.1 植物材料57
• 4.1.2 菌株及質(zhì)粒57
• 4.1.3 酶及試劑57-58
• 4.1.4 引物58
• 4.1.5 主要儀器設(shè)備58
• 4.1.6 試劑及培養(yǎng)基配制58-59
• 4.2 方法59-66
• 4.2.1 植物表達(dá)載體pCHF1301SaIMT和pCHF1301SaAQp的構(gòu)建59-62
• 4.2.2 K599發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備62
• 4.2.3 電擊法轉(zhuǎn)化K599感受態(tài)細(xì)胞62-63
• 4.2.4 發(fā)根農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化63-64
• 4.2.5 轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根的篩選及鑒定64-65
• 4.2.6 轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根的耐鹽性分析65-66
• 4.3 結(jié)果66-73
• 4.3.1 植物表達(dá)載體pCHF1301SaIMT和pCHF1301SaAQp的構(gòu)建與鑒定66
• 4.3.2 轉(zhuǎn)基因的大豆發(fā)狀根的篩選及鑒定66-67
• 4.3.3 轉(zhuǎn)SaIMT和SaAQP基因大豆發(fā)狀根的耐鹽性分析67-73
• 4.4 討論73-74
• 4.5 小結(jié)74-75
• 結(jié)論75-77
• 參考文獻(xiàn)77-90
• 作者簡(jiǎn)介及科研成果90-91
• 致謝91

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本文編號(hào)：500447