發(fā)布時(shí)間：2017-06-29 12:10

  本文關(guān)鍵詞：滲透壓對C.glycerinogenes關(guān)鍵代謝基因的調(diào)控研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：產(chǎn)甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes)是從自然界分離出來的一株耐高滲工業(yè)菌株,具有優(yōu)良的環(huán)境脅迫耐受性。磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PYK)和6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)分別是EMP途徑、HMP途徑中的關(guān)鍵酶,胞漿3-磷酸甘油脫氫酶(ctGPD)是甘油合成的關(guān)鍵酶,對耐高滲產(chǎn)甘油假絲酵母高效合成甘油、抵抗?jié)B透壓脅迫非常重要,其受滲透壓耐代謝調(diào)控機(jī)理研究進(jìn)展較少。本研究通過對C.glycerinogenes以上關(guān)鍵代謝酶及其基因在滲透壓條件下的發(fā)酵水平、蛋白和分子水平及轉(zhuǎn)錄水平的研究,初步揭示了滲透壓對Cgpfk1、Cgpfk2、Cgzwf及Cgpyk關(guān)鍵代謝基因的調(diào)控機(jī)制,為菌株改造和工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)。通過分子克隆技術(shù)獲得C.glycerinogenes關(guān)鍵代謝酶磷酸果糖激酶(兩個(gè)亞基)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、丙酮酸激酶的Cgpfk1、Cgpfk2、Cgzwf及Cgpyk推測編碼基因;在已有驗(yàn)證缺失株S.cerevisiae pfk2?和S.cerevisiae zwf?基礎(chǔ)上,利用PCR-mediated Technology基因敲除技術(shù)獲得S.cerevisiae pfk1?與S.cerevisiae pyk1?兩株缺失株;將Cgpfk1、Cgpfk2、Cgzwf及Cgpyk基因在相應(yīng)缺陷株中互補(bǔ)表達(dá)。酶活測定、功能互補(bǔ)結(jié)果表明Cgpfk1、Cgpfk2、Cgzwf及Cgpyk確為編碼磷酸果糖激酶(兩個(gè)亞基)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶,丙酮酸激酶的基因,為后續(xù)分子轉(zhuǎn)錄水平研究提供了可靠的基礎(chǔ)。為考察滲透壓對C.glycerinogenes的代謝調(diào)控,首先從發(fā)酵水平進(jìn)行分析,研究發(fā)現(xiàn),低滲(20 g·L-1 NaCl)脅迫下不影響菌體生長,其生長及甘油合成與無鹽時(shí)相似,但生長遲滯4 h,甘油積累量為無鹽對照的1.7倍;而高滲(50 g·L-1 NaCl)脅迫使菌體生長延遲12 h,生物量與對照相當(dāng),而甘油積累為對照的3倍;代謝流分析發(fā)現(xiàn),在甘油快速合成時(shí)期,高滲及低滲脅迫下碳流量均由HMP途徑向EMP途徑偏轉(zhuǎn),流向副產(chǎn)物乳酸,乙醇,丙酮酸合成及TCA循環(huán)流量減少,而高滲脅迫下的偏轉(zhuǎn)程度更大。PFK、PYK、G6PDH、ctGPD關(guān)鍵酶活水平分析發(fā)現(xiàn),與無鹽對照,不同滲透壓下,PFK與ctGPD酶活均高于無鹽對照(分別最高達(dá)1.6倍和3倍)、G6PDH略低于對照(大約80%),PYK明顯低于對照,說明滲透壓迫使EMP途徑總體碳流加強(qiáng),而進(jìn)入TCA循環(huán)的碳流量減少,ctGPD酶水平大大增加,使碳流主要合成甘油抵御胞外滲透壓;G6PDH略低于對照說明受滲透壓脅迫使細(xì)胞合成減緩(生長期延緩4-12 h);且隨滲透壓增加,這樣的酶水平調(diào)控愈強(qiáng)烈。在關(guān)鍵代謝酶基因轉(zhuǎn)錄水平研究結(jié)果表明:不同滲透壓下,Cggpd轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)十分明顯,最大上調(diào)7.7倍,而基因Cgpfk1、Cgpfk2、Cgzwf及Cgpyk轉(zhuǎn)錄水平差異性并不十分明顯,據(jù)此推測C.glycerinogenes在應(yīng)對外界滲透壓很可能同時(shí)受到酶活性調(diào)節(jié)和基因表達(dá)調(diào)節(jié)兩種調(diào)控方式,PFK、PYK、G6PDH等酶的活性受到某些調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié),而這些調(diào)節(jié)因子受到滲透壓調(diào)控,這需要進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：產(chǎn)甘油假絲酵母 滲透壓 代謝 基因 調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q933
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 第一章 緒論7-12
• 1.1 滲透壓與微生物的關(guān)系7-8
• 1.1.1 滲透壓與相容性物質(zhì)7
• 1.1.2 滲透壓對微生物生長的影響7
• 1.1.3 滲透壓影響碳硫在代謝途徑中的分布7-8
• 1.2 酵母糖代謝的關(guān)鍵酶8-10
• 1.2.1 磷酸果糖激酶8-9
• 1.2.2 6-磷酸葡萄糖脫氫酶9
• 1.2.3 丙酮酸激酶9
• 1.2.4 甘油-3 磷酸脫氫酶9-10
• 1.3 滲透壓對微生物的主要調(diào)控方式10
• 1.3.1 HOG途徑10
• 1.3.2 代謝應(yīng)答10
• 1.4 研究意義及主要研究內(nèi)容10-12
• 1.4.1 研究意義10-11
• 1.4.2 主要研究內(nèi)容11-12
• 第二章 材料與方法12-19
• 2.1 材料12-14
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與載體12-13
• 2.1.2 工具酶13
• 2.1.3 主要試劑13
• 2.1.4 培養(yǎng)基及用途13-14
• 2.1.5 主要儀器14
• 2.2 方法14-19
• 2.2.1 酵母基因組DNA的提取14-15
• 2.2.2 菌株平板生長實(shí)驗(yàn)15
• 2.2.3 目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增15-16
• 2.2.4 酵母總RNA提取16-17
• 2.2.5 逆轉(zhuǎn)錄17
• 2.2.6 熒光定量PCR17
• 2.2.7 產(chǎn)物測定17
• 2.2.8 酶活力的測定17-19
• 第三章 結(jié)果與討論19-38
• 3.1 關(guān)鍵代謝基因克隆及功能鑒定19-26
• 3.1.1 關(guān)鍵代謝基因的克隆19-20
• 3.1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建20-21
• 3.1.3 S. cerevisiae W303-1A pfk1、pyk1基因缺失株的構(gòu)建21-23
• 3.1.4 關(guān)鍵代謝基因的生理功能驗(yàn)證23-26
• 3.2 不同滲透壓下C. glycerinogenes代謝及發(fā)酵水平分析26-33
• 3.2.1 不同滲透壓對C. glycerinogenes生長和甘油積累的影響26-28
• 3.2.2 滲透壓對C. glycerinogenes發(fā)酵的影響28-30
• 3.2.3 滲透壓對C. glycerinogenes代謝流的影響30-33
• 3.3 不同滲透壓濃度下C. glycerinogenes關(guān)鍵酶水平及其轉(zhuǎn)錄水平分析33-38
• 3.3.1 不同滲透壓濃度下PFK、G6PDH、PYK、ctGPD關(guān)鍵酶水平變化33-35
• 3.3.2 不同滲透壓濃度下關(guān)鍵酶基因Cgpfk1、Cgpfk2、Cgzwf、Cgpyk和Cggpd轉(zhuǎn)錄水平變化35-38
• 主要結(jié)論與展望38-39
• 主要結(jié)論38
• 展望38-39
• 致謝39-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 附錄43-44
• 附錄A：作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文43-44
• 附錄B：C. glycerinogenes 代謝網(wǎng)絡(luò)所涉及的反應(yīng)式44

  本文關(guān)鍵詞：滲透壓對C.glycerinogenes關(guān)鍵代謝基因的調(diào)控研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：497843