本文關鍵詞：日本沼蝦抗菌肽基因的篩選和生物信息學分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor,ALF)是存在于甲殼動物和馬蹄蟹中的一種具有廣譜抗菌活性和抗病毒活性的抗菌肽。本研究中,我們通過從已經建立的日本沼蝦轉錄組中分析篩選出6種ALF基因序列,分別命名為MnALF1-6,并通過cDNA末端快速擴增的方法克隆了它們的全長cDNA序列。根據分子系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,這些基因的產物都與羅氏沼蝦同系物具有很高的相似性,尤其在LPS結構域部分。通過實時熒光定量PCR分析,在健康成蝦的血細胞中MnALF2和MnALF4的相對表達量最高,在腸道中MnALF3和MnALF4的相對表達量最高。在嗜水氣單胞菌的免疫誘導下,沼蝦不同組織中少數(shù)ALF基因出現(xiàn)下調表達,但多數(shù)ALF基因呈上調表達模式。為了驗證ALF的抗菌活性與LPS結構域的關系,我們合成了MnALF2的LPS結構域部分肽段,用來進行抑菌實驗和溶血活性實驗�？咕钚詫嶒灠l(fā)現(xiàn)合成的MnALF2多肽對革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌具有強大的廣譜抗菌活性,但對真菌沒有明顯的抑制活性。溶血實驗中合成的MnALF2多肽在濃度為0.67-33.50μM時表現(xiàn)出較弱的溶血活性(約10%),在濃度達到67μM時溶血活性約為22%。這項研究有利于我們更深入的了解淡水蝦先天免疫中ALFs的抗菌作用,并表明這些抗菌肽或其衍生物有可能成為一種高效的新型抗菌藥物。利用本地庫比對程序,在日本沼蝦轉錄組中查找羅氏沼蝦Crustin基因的同源序列,比對結果顯示日本沼蝦轉錄組中存在13條與羅氏沼蝦Crustin相似性很高的序列。我們對這13條序列進行生物信息學分析,結果顯示這13條序列都具有乳清酸蛋白(WAP)結構域且大多都存在信號肽,因此推測這13條序列應該是日本沼蝦中存在的Crustin基因序列,并將其命名為MnCrustin1-13。日本沼蝦Crustins是富含半胱氨酸的陽離子多肽,且一般在N端包含一個功能域(富含甘氨酸,脯氨酸或半胱氨酸),在C端含有一個帶有4個二硫鍵的乳清酸蛋白(WAP)結構域。
【關鍵詞】：抗脂多糖因子 先天性免疫 抗菌活性 Crustin 日本沼蝦 序列多樣性
【學位授予單位】：河北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 前言10-20
• 1.1 抗菌肽10-11
• 1.2 昆蟲抗菌肽11-13
• 1.3 甲殼動物抗菌肽13-19
• 1.3.1 Crustin15-17
• 1.3.2 抗脂多糖因子17-19
• 1.4 日本沼蝦及其研究意義19-20
• 第二章 抗脂多糖因子的鑒定和功能分析20-37
• 2.1 實驗材料20-21
• 2.1.1 實驗材料來源20
• 2.1.2 實驗試劑20
• 2.1.3 實驗菌種20-21
• 2.2 實驗方法21-25
• 2.2.1 日本沼蝦總RNA的提取和反轉錄21
• 2.2.2 克隆日本沼蝦ALFs基因的cDNA序列21-22
• 2.2.3 MnALFs基因序列的分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建22-23
• 2.2.4 日本沼蝦的免疫誘導和組織的收集23
• 2.2.5 提取組織總RNA并進行實時熒光定量PCR23
• 2.2.6 數(shù)據統(tǒng)計與分析23
• 2.2.7 合成多肽MnALF2的抗菌活性實驗23-24
• 2.2.8 合成多肽MnALF2的溶血活性測定24-25
• 2.3 實驗結果25-34
• 2.3.1 MnALFs的克隆及同源性分析25-28
• 2.3.2 MnALFs結構分析28-29
• 2.3.3 MnALFs的表達模式分析29-32
• 2.3.4 MnALF2合成肽的抑菌實驗結果32-33
• 2.3.5 MnALF2合成肽溶血實驗結果33-34
• 2.4 討論34-37
• 第三章 MnCrustin的生物信息學分析37-43
• 3.1 實驗方法37
• 3.1.1 MnCrustins基因序列的生物信息學分析37
• 3.1.2 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建37
• 3.2 實驗結果37-42
• 3.2.1 日本沼蝦Crustin基因cDNA序列分析37-39
• 3.2.2 日本沼蝦Crustin基因的系統(tǒng)發(fā)育及蛋白結構分析39-42
• 3.3 討論42-43
• 第四章 結論43-44
• 參考文獻44-51
• 致謝51-52
• 攻讀學位期間取得的成果52

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