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擬南芥葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)突變體E1991的圖位克隆及基因功能分析

發(fā)布時(shí)間:2017-06-18 23:01

  本文關(guān)鍵詞:擬南芥葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)突變體E1991的圖位克隆及基因功能分析,,由筆耕文化傳播整理發(fā)布。


【摘要】:植物的光合作用是維持地球生態(tài)平衡的重要一環(huán),是食物鏈的物質(zhì)基礎(chǔ)。葉綠體是大部分光合自養(yǎng)生物進(jìn)行同化作用的細(xì)胞器,其形態(tài)因植物種類不同而具有較大差異。作為一種半自主細(xì)胞器,其發(fā)育調(diào)控及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)極其復(fù)雜,不僅受核基因編碼蛋白的調(diào)控,更受到自身基因表達(dá)的影響。正是由于這種復(fù)雜性,雖然其發(fā)育及調(diào)控一直備受關(guān)注,但其相關(guān)分子機(jī)制目前尚未完全明了。對其深入細(xì)微的研究,不僅僅可以滿足人類的求知欲,更能廣泛用于改良作物的農(nóng)藝性狀等,具有十分重要的指導(dǎo)意義。本研究以擬南芥為材料,使用甲基磺酸乙酯(ethylmethyl sulfonate,EMS)對Col-0野生型擬南芥種子進(jìn)行處理,使其發(fā)生單堿基突變,發(fā)生表型的變化,從而構(gòu)建突變體庫。使用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù),篩選出葉綠素?zé)晒鈪?shù)F_0和F_m均偏高,F_v/F_m較低的一種突變體,命名為E1991。對其生長表型研究發(fā)現(xiàn),該突變體在萌發(fā)上對ABA處理不敏感,營養(yǎng)生長期較WT長,滯綠,且真葉的葉綠素a、葉綠素b和胡蘿卜素含量均偏高。通過遺傳試驗(yàn)分析,確認(rèn)該突變體屬于單基因隱性突變。與Landsberg野生型雜交后自交,構(gòu)建F_2代分離群體,使用圖位克隆的方式將突變位點(diǎn)定位在F3F19 BAC(Bacteria Artificial Chromosome)附近,并通過基因比對,找到了突變基因CFNY。該基因第95位堿基由G突變?yōu)锳,對應(yīng)編碼的氨基酸由精氨酸突變?yōu)榘腚装彼帷FNY的表達(dá)結(jié)構(gòu)由7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子構(gòu)成,編碼一個(gè)功能未知的蛋白。為研究該基因的功能以及在該基因表達(dá)中的組織定位與亞細(xì)胞定位,我們分別構(gòu)建了回補(bǔ)、超表達(dá)、1391-GUS、永久GFP載體與瞬時(shí)GFP載體。研究結(jié)果表明,CFNY是與擬南芥葉綠體發(fā)育相關(guān)的一個(gè)未知基因,可能參與植物衰老及光合生理信號調(diào)控。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,該基因可能定位于細(xì)胞內(nèi)膜及葉綠體外膜結(jié)構(gòu)附近,該試驗(yàn)結(jié)果還需進(jìn)一步共定位進(jìn)行確認(rèn)。對相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)突變體E1991和超表達(dá)植株中,CAB表達(dá)量均有所下調(diào),而RBCS表達(dá)量有一定的上調(diào)。其相關(guān)信號通路還有待進(jìn)一步探索。
【關(guān)鍵詞】:擬南芥 葉綠素?zé)晒?/strong> 圖位克隆 功能分析
【學(xué)位授予單位】:河南大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2016
【分類號】:Q943.2
【目錄】:
  • 摘要4-6
  • ABSTRACT6-8
  • 縮寫詞(Abbreviation)8-12
  • 1 前言12-23
  • 1.1 葉綠體的發(fā)育研究進(jìn)展12-13
  • 1.1.1 葉綠體研究概述12
  • 1.1.2 多因素影響葉綠體發(fā)育12-13
  • 1.2 葉綠素的代謝13-17
  • 1.2.1 葉綠素的合成代謝13-14
  • 1.2.2 葉綠素的分解代謝14-16
  • 1.2.3 光合色素與植物衰老16-17
  • 1.3 光系統(tǒng)與能量代謝17-19
  • 1.3.1 光系統(tǒng)Ⅰ與光系統(tǒng)Ⅱ17-18
  • 1.3.2 非光化學(xué)淬滅18-19
  • 1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的研究進(jìn)展19-23
  • 1.4.1 葉綠素?zé)晒鈾C(jī)理和測量19-20
  • 1.4.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的生物學(xué)意義20-23
  • 2 立題依據(jù)23-24
  • 3 材料與方法24-42
  • 3.1 常用儀器24
  • 3.2 實(shí)驗(yàn)材料、載體和菌株24-25
  • 3.2.1 植物實(shí)驗(yàn)材料24
  • 3.2.2 實(shí)驗(yàn)載體與菌株24-25
  • 3.3 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑25
  • 3.4 常用培養(yǎng)基和溶液的配制25-27
  • 3.4.1 常用培養(yǎng)基的配制25-26
  • 3.4.2 溶液的配制26-27
  • 3.4.3 抗生素的配制27
  • 3.5 實(shí)驗(yàn)方法27-42
  • 3.5.1 擬南芥的培養(yǎng)27-28
  • 3.5.2 擬南芥的雜交28
  • 3.5.3 擬南芥DNA的提取28-29
  • 3.5.4 可溶性蛋白提取和含量的測定29
  • 3.5.5 可溶性總糖提取和含量的測定29-30
  • 3.5.6 葉綠素提取和含量的測定30
  • 3.5.7 Trizol法提取擬南芥RNA30-31
  • 3.5.8 反轉(zhuǎn)錄制備擬南芥cDNA31
  • 3.5.9 PCR引物的設(shè)計(jì)31-33
  • 3.5.10 載體構(gòu)建與重組質(zhì)粒的鑒定33-34
  • 3.5.11 瓊脂糖凝膠的配制與回收34-35
  • 3.5.12 T-DNA插入突變體的純合鑒定35
  • 3.5.13 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備35-36
  • 3.5.14 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞36-37
  • 3.5.15 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備37
  • 3.5.16 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞37
  • 3.5.17 重組菌落與質(zhì)粒的鑒定37-38
  • 3.5.18 質(zhì)粒DNA的小量提取38
  • 3.5.19 農(nóng)桿菌侵染38
  • 3.5.20 轉(zhuǎn)基因植株的篩選38-39
  • 3.5.21 GUS染色方法39
  • 3.5.22 圖位克隆39-40
  • 3.5.23 瞬轉(zhuǎn)40-42
  • 4 結(jié)果與分析42-55
  • 4.1 突變體的獲得42
  • 4.2 突變體的遺傳學(xué)分析42-43
  • 4.3 突變體的圖位克隆43-46
  • 4.3.1 F2代分離群體的構(gòu)建43-44
  • 4.3.2 基因粗定位結(jié)果44
  • 4.3.3 基因細(xì)定位結(jié)果44-45
  • 4.3.4 基因測序結(jié)果45-46
  • 4.3.5 Salk line突變體表型分析46
  • 4.4 突變體E1991的發(fā)育表型46-49
  • 4.4.1 E1991突變體與Col-0 野生型葉綠素含量的測定46-47
  • 4.4.2 E1991突變體與Col-0 野生型可溶性蛋白含量的測定47
  • 4.4.3 E1991突變體與Col-0 野生型可溶性總糖含量的測定47-48
  • 4.4.4 ABA處理下的萌發(fā)差異48-49
  • 4.4.5 相關(guān)基因的表達(dá)分析49
  • 4.5 回補(bǔ)載體的構(gòu)建與回補(bǔ)植株的篩選49-51
  • 4.5.1 回補(bǔ)載體E1991::pCAMBIA1300-COM的構(gòu)建49-50
  • 4.5.2 回補(bǔ)植株的篩選50
  • 4.5.3 回補(bǔ)植株的表型分析50-51
  • 4.6 超表達(dá)載體E1991::p-S1300+的構(gòu)建51
  • 4.7 E1991::GFP載體的構(gòu)建51-53
  • 4.7.1 E1991::pHBT-GFP-NOS載體的構(gòu)建及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化51-52
  • 4.7.2 E1991::S1300+-GFP載體的構(gòu)建及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化52-53
  • 4.8 E1991::pCAMBIA1391-GUS載體的構(gòu)建53
  • 4.9 蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建53-55
  • 5 討論55-57
  • 結(jié)論57-58
  • 參考文獻(xiàn)58-65
  • 致謝65-66

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