發(fā)布時(shí)間：2017-06-14 16:07

  本文關(guān)鍵詞：奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮細(xì)胞的表達(dá)定位及對(duì)SCD1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)作為核轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)于細(xì)胞脂肪合成酶基因的表達(dá)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。論文旨在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中研究SREBP1對(duì)于SCD1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,為進(jìn)一步明確SREBP1對(duì)于靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)�！痉椒ā恳院伤固鼓膛Ｈ橄俳M織的c DNA為模板,采用分段克隆的方法獲得SREBP1基因的編碼序列,通過(guò)重組酶與pc DNA3.1載體進(jìn)行重組環(huán)化構(gòu)建pc DNA3.1-SREBP1表達(dá)載體,將構(gòu)建的載體測(cè)序驗(yàn)證后提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染奶牛乳腺上皮細(xì)胞。以EIF3K基因?yàn)閮?nèi)參基因,采用熒光定量PCR檢測(cè)SREBP1基因m RNA的表達(dá)差異;采用免疫熒光的方法對(duì)SREBP1進(jìn)行標(biāo)記,以DAPI復(fù)染細(xì)胞核,激光共聚焦觀察SREBP1蛋白的亞細(xì)胞定位;轉(zhuǎn)染含有不同調(diào)控元件的SCD基因啟動(dòng)子,同時(shí)轉(zhuǎn)染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作為處理,熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析啟動(dòng)子活性;分別轉(zhuǎn)染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1載體,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3啟動(dòng)子活性與SREBP1之間的量效關(guān)系。【結(jié)果】分段克隆得到的PCR產(chǎn)物分別為1 170、1 116、363和900 bp的片段,經(jīng)過(guò)與pc DNA3.1載體重組后獲得pc DNA3.1-SREBP1表達(dá)載體,經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)除1個(gè)無(wú)義突變外,與標(biāo)準(zhǔn)序列完全相同,整個(gè)序列長(zhǎng)度達(dá)到3 510bp;將pc DNA3.1-SREBP1載體轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞后,Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組相比,SREBP1基因的m RNA表達(dá)倍數(shù)增強(qiáng)130.4倍(P0.001);激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn),DAPI染色的細(xì)胞核呈藍(lán)色,免疫熒光標(biāo)記的SREBP1呈綠色,二者融合后呈現(xiàn)青色,共定位在乳腺上皮細(xì)胞核中;啟動(dòng)子活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1處理能夠極顯著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4啟動(dòng)子的活性(P0.001),分別比對(duì)照組提高了1.0倍和0.7倍,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1處理后,與p GL3-SCD2的啟動(dòng)子活性持續(xù)下降相比,p GL3-SCD3的啟動(dòng)子活性從59.81上升到108.43(P0.001),二者存在劑量效應(yīng)關(guān)系,結(jié)合SCD2和SCD 3啟動(dòng)子上主要的結(jié)構(gòu)差異SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推測(cè)此序列可能是SREBP1調(diào)控SCD基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的結(jié)合序列。【結(jié)論】克隆構(gòu)建奶牛SREBP1基因表達(dá)載體,亞細(xì)胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮細(xì)胞核中,SREBP1可以與SRE調(diào)控元件結(jié)合促進(jìn)SCD1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。
【作者單位】： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： 奶牛 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 乳腺上皮細(xì)胞 亞細(xì)胞定位 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【基金】：國(guó)家“973”項(xiàng)目(2011CB100802) 國(guó)家自然科學(xué)基金(31072009) 國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專(zhuān)項(xiàng)(2014ZX0801015B) 河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(15A230020) 河南省基礎(chǔ)與前沿項(xiàng)目(162300410258)
【分類(lèi)號(hào)】：S823
【正文快照】： Expression and Localization of Bovine SREBP1 Protein andRegulation of the Transcription of SCD1 Promoter in BovineMammary Epithelial CellHAN Li-qiang,WANG Yue-ying,WANG Lin-feng,ZHU He-shui,ZHONG Kai,CHU Bei-bei,YANG Guo-yu(College of Animal Science and

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1 王月影;朱河水;王艷玲;;乳腺上皮細(xì)胞的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)研究進(jìn)展[J];江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2008年06期

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3 吳媛媛;李鍵;楊櫟;畢琳;田甜;;牦牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)的研究[J];西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2009年04期

4 弓超;王凌云;周歡敏;;牛乳腺上皮細(xì)胞體外分離和培養(yǎng)[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2011年07期

5 李吉霞;葛秀國(guó);王文秀;張涌;;牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2012年07期

6 符梅;熊顯榮;高川;李宇;王樹(shù)茂;李鍵;;麥洼牦牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2012年11期

7 郝明超;劉r

本文編號(hào)：449896