本文關(guān)鍵詞：飛蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的表達(dá)及酶學(xué)特性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)是昆蟲幾丁質(zhì)降解過程中的重要酶類。研究旨在利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得高純度LmNAG1蛋白并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行分析,探究該酶在飛蝗(Locusta migratoria)生長發(fā)育過程中的生物學(xué)功能,為飛蝗綠色防控分子靶標(biāo)研發(fā)提供理論與實(shí)踐依據(jù)�！痉椒ā扛鶕�(jù)Lm NAG1的cDNA全長序列(Gen Bank:JX888720.1)設(shè)計(jì)包含酶切位點(diǎn)Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ和6×His標(biāo)簽的引物。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增包含開放閱讀框的目標(biāo)片段,雙酶切后連接至pFast Bac~(TM)-Dual載體上。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中,通過Tn7轉(zhuǎn)座子把目的基因轉(zhuǎn)座到桿狀病毒基因組上,用藍(lán)白斑結(jié)合抗生素篩選。挑取白斑用pUC/M13引物來擴(kuò)增目的條帶,挑選帶目的基因全長的重組桿狀病毒質(zhì)粒(baculovirus plasmid,Bacmid)。用轉(zhuǎn)染試劑將重組Bacmid轉(zhuǎn)染至草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢細(xì)胞系Sf9中,72 h內(nèi)連續(xù)觀察細(xì)胞形態(tài),當(dāng)出現(xiàn)感染跡象后收集細(xì)胞,離心,取上清得到P1代重組病毒粒子。用P1代病毒粒子去感染Sf9細(xì)胞,裂解并提取蛋白,Western blot檢測目的蛋白是否成功表達(dá)。之后大量感染Sf9細(xì)胞,提取蛋白,利用Ni-NTA瓊脂糖親和層析柱和陰離子交換柱Q對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化,取最純的餾分用Bradford法測定蛋白濃度。采用4MU-GlcNAc為底物對(duì)重組目的蛋白LmNAG1的動(dòng)力學(xué)參數(shù)、最適溫度和最適pH進(jìn)行測定。【結(jié)果】克隆得到包含1 845 bp LmNAG1全長的pFast Bac-LmNAG1重組質(zhì)粒,酶切驗(yàn)證與目標(biāo)條帶一致。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中,PCR擴(kuò)增挑選出純白斑,成功將LmNAG1全長序列構(gòu)建到桿狀病毒基因組上。將重組Bacmid轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞,72 h后在顯微鏡下觀察可見細(xì)胞膨大,邊緣不規(guī)則等感染跡象。離心收集重組病毒粒子感染新的Sf9細(xì)胞,72 h后收集細(xì)胞,Western blot檢測發(fā)現(xiàn)在67 kD附近有明顯條帶,與LmNAG1的理論分子量一致,獲得帶6×His標(biāo)簽的融合蛋白。大量感染收集細(xì)胞提取蛋白,經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖層析純化,進(jìn)一步透析除鹽后用陰離子交換柱Q二次純化,得到了高純度的目的蛋白。用Bradford法測定最純的E3組分的蛋白濃度為0.057μg·μL~(-1)。體外活性測定結(jié)果表明LmNAG1的最適pH為8.0,且在pH 6.0—8.0范圍內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性;LmNAG1的最適溫度為40℃,在40℃以下具有很高的穩(wěn)定性,當(dāng)溫度高于45℃時(shí)熱穩(wěn)定性迅速下降;采用4MU-GlcNAc為底物測得LmNAG1具有水解β-1,4糖苷鍵的活性,可以釋放出4MU,它的動(dòng)力學(xué)參數(shù)K_m值為(0.28±0.02)mmol·L~(-1),K_(cat)值為(902.88±38.15)s~(-1)�！窘Y(jié)論】成功獲得高純度且具活性的LmNAG1蛋白,其可水解β-1,4糖苷鍵連接的幾丁質(zhì)寡糖,與已知昆蟲NAG1具有相似的生物學(xué)功能,即參與幾丁質(zhì)的降解。
【作者單位】： 山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所;山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： 飛蝗 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG) 幾丁質(zhì)降解 蛋白表達(dá) 酶學(xué)特性
【基金】：國家自然科學(xué)基金(31272380,31672364) 山西省科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)項(xiàng)目(2015091010)
【分類號(hào)】：S433.2
【正文快照】： The Heterogenous Expression and Enzymatic Characteristics ofβ-N-acetylglucosaminidase from Locusta migratoriaSONG Hui-fang1,2,3,LI Ying-long1,2,3,MA En-bo1,3,ZHANG Jian-zhen1,3(1Institute of Applied Biology,Shanxi University,Taiyuan 030006;2College of L

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1 宋水山,賈振華,高振賢;Ralstonia eutropha CH34酯酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)及酶學(xué)特性[J];河北省科學(xué)院學(xué)報(bào);2001年01期

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本文編號(hào)：449644