本文關(guān)鍵詞：番木瓜果實(shí)成熟差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究及UBI基因克隆分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：番木瓜是番木瓜科(Caricaceae)番木瓜屬(Carica L.)的多年生草本植物。作為典型的呼吸躍變型果實(shí),番木瓜因采后迅速軟化腐爛導(dǎo)致的損失制約了番木瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前,對番木瓜果實(shí)成熟機(jī)理的研究主要集中在生理水平及轉(zhuǎn)基因方面,對番木瓜果實(shí)發(fā)育成熟過程的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究尚在起步階段。本研究以0.5μL/L乙烯利和1μL/L的1-MCP處理的番木瓜果實(shí)作為研究材料,對番木瓜果實(shí)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)和UBI家族基因在果實(shí)成熟過程中的功能進(jìn)行探究。從基因和蛋白水平研究乙烯和1-MCP調(diào)控番木瓜果實(shí)成熟的過程,可以更加全面的了解果實(shí)成熟的分子機(jī)制,且對果實(shí)貯藏保鮮技術(shù)的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。本研究主要結(jié)果如下：(1)乙烯利和1-MCP處理后的番木瓜果實(shí),其果皮顏色、硬度、果實(shí)的丙二醛含量、過氧化物酶活性以及可溶性蛋白含量在處理后12h到24h之間表現(xiàn)出差異,而可溶性固形物在處理后的變化不明顯,說明番木瓜果實(shí)的中糖、維生素、番木瓜堿等營養(yǎng)成分含量可能在綠熟期就已達(dá)到高峰。(2)采用酚抽提取法和iTRAQ技術(shù)對處理后24h的果肉蛋白進(jìn)行提取鑒定�？偣驳玫蕉増D譜數(shù)為217907,匹配到的譜圖數(shù)為16957張,其中匹配到特有的肽段的譜圖數(shù)量是8842張,鑒定到的肽段數(shù)及特有肽段序列分別為6582和3853,其中鑒定到3048種蛋白質(zhì)。通過對番木瓜果實(shí)iTRAQ技術(shù)蛋白質(zhì)譜表達(dá)分析：三個(gè)處理中總共得到192種差異蛋白,其中上調(diào)蛋白有79種,下調(diào)蛋白有113種。其中乙烯/CK上調(diào)蛋白49個(gè),下調(diào)蛋白73個(gè),1-MCP/CK上調(diào)蛋白30個(gè),下調(diào)蛋白40個(gè)。(3)乙烯/CK和1-MCP/CK的差異蛋白共同參與的顯著富集代謝途徑是基本代謝途徑與糖酵解和糖異生途徑,其中乙烯/CK代謝途徑涉及55種蛋白,占差異蛋白總數(shù)的51.89%,1-MCP/CK涉及38種蛋白,占差異蛋白總數(shù)的62.3%：糖酵解和糖異生途徑乙烯/CK涉及14種蛋白,占差異蛋白總數(shù)的13.21%,1-MCP/CK涉及8種蛋白,占差異蛋白總數(shù)的13.11%。(4)通過GO富集分析,得到一些與果實(shí)成熟軟化相關(guān)的關(guān)鍵蛋白,糖類代謝過程中的尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶、烯醇酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和α-淀粉酶等,細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白有木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和磷脂酶D等,蛋白水解及合成相關(guān)蛋白木瓜蛋白酶、蛋白二硫化物歧化酶等,參與脅迫響應(yīng)與防御相關(guān)的蛋白抗壞血酸還原酶、水通道蛋白等,乙烯生物合成相關(guān)蛋白蛋氨酸合成酶。(5)選取6個(gè)差異蛋白在mRNA的水平上進(jìn)行驗(yàn)證,得到66.7%的基因表達(dá)規(guī)律與蛋白質(zhì)表達(dá)規(guī)律相一致。其中,α-淀粉酶1、蛋氨酸合成酶、尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶和半胱氨酸蛋白酶在1-MCP和乙烯處理后的番木瓜果實(shí)中表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)具有相似性。而α-淀粉酶2在乙烯和1-MCP處理中蛋白表達(dá)與mRNA水平完全相反,木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶在乙烯處理后的果實(shí)中蛋白質(zhì)水平表現(xiàn)為下調(diào),而轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)為上調(diào),但是在1-MCP處理中,蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)相一致,均為上調(diào)。(6)為探究番木瓜泛素家族成員的序列特征及表達(dá)模式,采用RT-PCR克隆出3個(gè)泛素基因,其開放閱讀框(ORF)分別編碼306、308和156個(gè)氨基酸,分別命名為CpUBI1、CpUBI2和CpUBI3。序列分析結(jié)果表明CpUBI1和CpUBI2含有4個(gè)連續(xù)的UBQ Superfamily結(jié)構(gòu)域,屬于多聚泛素家族基因,CpUBI3有一個(gè)UBQ Superfamily和Ribosomal S27a Superfamily結(jié)構(gòu)域,屬于S27a泛素延伸蛋白家族基因。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究其在乙烯利、1-MC及清水對照處理后果實(shí)中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)CpUBI1和CpUBI2的表達(dá)量顯著高于CpUBI3,且乙烯利處理的番木瓜果實(shí)中三個(gè)泛素基因表達(dá)量均上調(diào),推測多聚泛素基因受乙烯的誘導(dǎo)增加表達(dá)量,從而參與調(diào)控番木瓜果實(shí)的成熟衰老。
【關(guān)鍵詞】：番木瓜 iTRAQ 果實(shí)成熟 乙烯 1-MCP 泛素家族基因
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S667.9
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略詞表11-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-19
• 1 國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀13-15
• 1.1 乙烯與1-MCP在番木瓜果實(shí)成熟軟化中的研究13
• 1.2 番木瓜果實(shí)貯藏保鮮技術(shù)的研究13-15
• 2 蛋白質(zhì)組學(xué)在果實(shí)軟化機(jī)理中的應(yīng)用15-17
• 2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)概述15
• 2.2 iTRAQ技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組學(xué)上的應(yīng)用15-16
• 2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)在果實(shí)成熟衰老研究中的應(yīng)用16-17
• 3 泛素基因功能的研究進(jìn)展17
• 4 本文的研究目的和內(nèi)容17-19
• 4.1 目的和意義17-18
• 4.2 主要研究內(nèi)容18-19
• 第二章 乙烯與1-MCP處理采后番木瓜果實(shí)的品質(zhì)變化19-27
• 1 材料與方法19
• 1.1 植物材料19
• 1.2 方法19-21
• 1.2.1 果皮顏色的觀察記錄19
• 1.2.2 果實(shí)硬度的測定19
• 1.2.3 可溶性固形物含量的測定19-20
• 1.2.4 過氧化物酶活性的測定20
• 1.2.5 丙二醛含量的測定20
• 1.2.6 可溶性蛋白的測定20-21
• 2 結(jié)果與分析21-25
• 2.1 不同處理后番木瓜果皮顏色的變化21
• 2.2 不同處理后番木瓜果實(shí)硬度的變化21-22
• 2.3 不同處理后番木瓜果實(shí)可溶性固形物的變化22-23
• 2.4 不同處理后番木瓜果實(shí)丙二醛(MDA)變化23-24
• 2.5 不同處理后番木瓜果實(shí)過氧化物酶(POD)活性的變化24
• 2.6 不同處理后番木瓜果實(shí)可溶性蛋白含量的變化24-25
• 3 討論25-27
• 第三章 乙烯與1-MCP處理后番木瓜果實(shí)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)27-47
• 1 材料與方法27-30
• 1.1 番木瓜果實(shí)蛋白提取27
• 1.2 蛋白質(zhì)濃度測定27-28
• 1.3 SDS電泳28
• 1.4 蛋白質(zhì)酶解28
• 1.5 iTRAQ標(biāo)記28
• 1.6 SCX分離28
• 1.7 基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MSMS分析28-29
• 1.8 蛋白數(shù)據(jù)的選擇與分析29
• 1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析29-30
• 2 結(jié)果與分析30-43
• 2.1 番木瓜果實(shí)蛋白質(zhì)的定量分析30-31
• 2.2 SDS-PAGE電泳鑒定蛋白質(zhì)質(zhì)量31-32
• 2.3 蛋白鑒定質(zhì)量評估32-33
• 2.4 iTRAQ測序結(jié)果33-34
• 2.5 蛋白質(zhì)組所有基因的功能分類34-36
• 2.6 差異蛋白的確定36-37
• 2.7 差異蛋白的GO富集分析37-38
• 2.8 差異蛋白KEGG Pathway代謝通路注釋38-40
• 2.9 熒光定量RT-qPCR驗(yàn)證40-43
• 3 討論43-47
• 3.1 番木瓜果實(shí)蛋白質(zhì)組分的分析43-44
• 3.2 番木瓜果實(shí)成熟過程中參與糖類代謝過程的相關(guān)蛋白44-45
• 3.3 番木瓜果實(shí)成熟過程中參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白45
• 3.4 番木瓜果實(shí)成熟過程中參與蛋白水解及合成相關(guān)蛋白45-46
• 3.5 番木瓜果實(shí)成熟過程中參與水分代謝相關(guān)的蛋白46
• 3.6 差異蛋白質(zhì)表達(dá)量驗(yàn)證46-47
• 第四章 番木瓜果實(shí)UBI基因的克隆與分析47-56
• 1 材料與方法47-49
• 1.1 材料與試劑47
• 1.2 總RNA提取及cDNA的合成47-48
• 1.3 泛素家族基因cDNA克隆48
• 1.4 生物信息學(xué)分析48
• 1.5 泛素家族基因在不同處理的番木瓜果肉中的表達(dá)分析48-49
• 2 結(jié)果與分析49-54
• 2.1 泛素家族基因的克隆與序列分析49-50
• 2.2 CpUBI家族基因的多重序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析50-52
• 2.3 CpUBI家族基因的蛋白結(jié)構(gòu)分析52-53
• 2.4 CpUBI家族基因在番木瓜不同成熟時(shí)期的表達(dá)53-54
• 3 討論54-56
• 第五章 小結(jié)與展望56-58
• 1 小結(jié)56-57
• 2 展望57-58
• 參考文獻(xiàn)58-70
• 附錄1 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量分布70
• 附錄2 番木瓜果實(shí)蛋白質(zhì)豐度比分布圖70-71
• 附錄3 差異蛋白的GO富集分析71-88
• 致謝88

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