本文關鍵詞：重組副溶血弧菌過氧化氫酶catVPF1，catVPR2的克隆表達及基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一種革蘭氏陰性嗜鹽短菌,廣泛分布于海水、泥沙及海產(chǎn)品體內(nèi),是近年來人類食用海產(chǎn)品后引起的腸道疾病的主要原因之一,其致病性已引起世界性的廣泛關注,對其致病機理的研究也越來越深入。過氧化氫酶(hydrogen peroxidase)又稱觸酶(catalase,CAT)是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的末端抗氧化酶。過氧化氫酶常被廣泛用于醫(yī)學診斷、臨床分析、食品消毒、以及造紙、紡織、制漿等工業(yè)。本課題來源于在副溶血弧菌VP110基因組中發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶(catVPF1)及同工酶(catVPR2)。為研究這兩種過氧化氫酶的活性以及過氧化氫酶在VP110體內(nèi)的作用,利用原核表達系統(tǒng)表達目的蛋白后通過試劑盒檢測目的蛋白的比酶活,同時利用over-lap PCR方法設計敲除過氧化氫酶基因,觀察各表型菌株的抗氧化能力以及生長狀況。利用RT-PCR實驗方法檢測在過氧化氫的培養(yǎng)基中過氧化氫酶基因表達量的變化。實驗結果表明,副溶血弧菌過氧化氫酶在大腸桿菌中能有效表達,catVPF1測定結果為242.02 IU/mg,catVPR2測定結果為197.962 IU/mg。攜帶過氧化氫酶基因的副溶血弧菌菌株對氧化劑有一定抗性,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)野生型菌株比過氧化氫酶基因缺失菌株抗氧化能力較強;單過氧化氫酶基因缺失菌株比雙基因缺失菌株抗氧化能力強。RT-PCR檢測結果顯示在無氧環(huán)境下,隨著過氧化氫濃度的增加過氧化氫酶基因表達總體下調(diào);在有氧環(huán)境一定過氧化氫濃度下,過氧化氫酶基因表達量會隨著過氧化氫的濃度升高而表達上調(diào)。當過氧化氫濃度過高時,過氧化氫酶基因表達受到抑制。綜上所述,副溶血弧菌體內(nèi)過氧化氫酶對菌的生長有一定的影響,可以使其在氧化環(huán)境中存活能力得到提高。
【關鍵詞】：副溶血弧菌 過氧化氫酶 酶活力 基因敲除 RT-PCR
【學位授予單位】：湖北師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;S941.4
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-16
• 1.1 副溶血弧菌的研究進展10-13
• 1.1.1 副溶血弧菌的生長特性10-11
• 1.1.2 副溶血弧菌致病機理和主要毒力因子11-12
• 1.1.3 預防副溶血弧菌感染方法12
• 1.1.4 副溶血弧菌研究現(xiàn)狀12-13
• 1.2 過氧化氫酶的研究進展13-14
• 1.2.1 過氧化氫酶的來源13-14
• 1.2.2 過氧化氫酶的應用14
• 1.3 本課題的研究目的和創(chuàng)新14-16
• 第二章 過氧化氫酶cat VPF1和cat VPR2的克隆和重組菌的構建16-26
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 菌株及培養(yǎng)條件16
• 2.1.2 質(zhì)粒16-17
• 2.2 常用緩沖液17
• 2.3 分子試劑17-18
• 2.4 實驗方法18-22
• 2.4.1 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的制備及提取18
• 2.4.2 細菌基因組DNA的制備18-19
• 2.4.3 質(zhì)粒DNA的操作19
• 2.4.4 表達載體構建19-20
• 2.4.5 感受態(tài)細胞的制備與轉化20-21
• 2.4.6 重組菌的篩選與鑒定21-22
• 2.4.7 菌種保藏與測序22
• 2.5 結果22-25
• 2.5.1 副溶血弧菌基因組的提取22-23
• 2.5.2 PCR擴增cat基因及純化23-24
• 2.5.3 重組質(zhì)粒載體的構建24
• 2.5.4 重組菌的鑒定結果24-25
• 2.5.5 菌種保藏測序25
• 2.6 討論25-26
• 第三章 過氧化氫酶cat VPF1和cat VPR2的表達條件優(yōu)化和活性測定26-37
• 3.1 常用試劑26
• 3.1.1 蛋白純化緩沖液26
• 3.1.2 其他常用試劑26
• 3.2 蛋白誘導表達純化及定量26-29
• 3.2.1 目的蛋白誘導表達26-27
• 3.2.2 目的蛋白純化27
• 3.2.3 SDS-PAGE檢測蛋白純化效果27-28
• 3.2.4 蛋白含量的測定28-29
• 3.3 蛋白酶活力的測定29-30
• 3.4 實驗結果30-35
• 3.4.1 SDS-PAGE電泳檢測蛋白誘導及純化效果30-31
• 3.4.2 蛋白濃度測定結果31-33
• 3.4.3 過氧化氫蛋白酶活測定33-34
• 3.4.4 蛋白表達條件優(yōu)化結果34-35
• 3.5 討論35-37
• 第四章 cat基因缺失菌株的構建與鑒定37-43
• 4.1 試驗材料和方法37-40
• 4.1.1 試驗材料37
• 4.1.2 目的基因敲除和回補37-38
• 4.1.3 缺失菌的構建38-39
• 4.1.4 回補菌的構建39-40
• 4.2 實驗結果40-42
• 4.2.1 基因敲除與缺失菌株的構建40-41
• 4.2.2 缺失菌株的鑒定41-42
• 4.3 討論42-43
• 第五章 野生型菌株與突變體菌株的生長特性研究43-52
• 5.1 基因缺失菌株的生長曲線測定43-45
• 5.1.1 材料與方法43
• 5.1.2 結果43-45
• 5.1.3 討論45
• 5.2 各表型菌在氧化環(huán)境下生長特性研究45-48
• 5.2.1 濾紙片法測定各表型菌在過氧化氫存在下的抑菌圈45-46
• 5.2.2 各表型菌抑菌圈結果與分析46-48
• 5.3 各表型菌在不同過氧化物環(huán)境下生長狀況探究48-51
• 5.3.1 各表型弧菌在高濃度過氧化氫環(huán)境中的生長狀況48-49
• 5.3.2 各表型弧菌在高濃度異丙苯環(huán)境中的生長狀況49-50
• 5.3.3 各表型弧菌在高濃度的叔丁基過氧化氫環(huán)境中生長狀況50-51
• 5.4 結論與分析51-52
• 第六章 cat在氧化脅迫下對副溶血弧菌VP110基因的調(diào)控52-62
• 6.1 材料與方法52-53
• 6.1.1 試驗材料52
• 6.1.2 細菌RNA提取和反轉錄52-53
• 6.2 有氧環(huán)境下cat在氧化脅迫下對基因表達的調(diào)控53-55
• 6.2.1 副溶血弧菌總RNA提取與定量53-54
• 6.2.2 基因組DNA的去除及c DNA的合成54
• 6.2.3 RT-PCR54-55
• 6.3 無氧環(huán)境下cat在氧化脅迫下對基因表達的調(diào)控55-56
• 6.3.1 無氧環(huán)境氧化脅迫下副溶血弧菌總RNA提取與定量55
• 6.3.2 基因組DNA的去除及c DNA的合成55-56
• 6.3.3 q PCR56
• 6.4 結果與分析56-62
• 6.4.1 有氧環(huán)境氧化脅迫下副溶血弧菌VP110總RNA的提取56-57
• 6.4.2 Real-Time PCR方法檢測cat基因在有氧環(huán)境氧化脅迫下的轉錄水平57-59
• 6.4.3 無氧環(huán)境下副溶血弧菌VP110總RNA的提取59
• 6.4.4 Real-Time PCR方法檢測cat基因在無氧環(huán)境下的轉錄水平59-62
• 第七章 總結與討論62-63
• 致謝63-64
• 參考文獻64-71
• 附錄一 攻讀碩士期間發(fā)表論文目錄71-72
• 縮略語表72

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