發(fā)布時(shí)間：2017-05-30 16:06

  本文關(guān)鍵詞：重組副溶血弧菌過氧化氫酶catVPF1，catVPR2的克隆表達(dá)及基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一種革蘭氏陰性嗜鹽短菌,廣泛分布于海水、泥沙及海產(chǎn)品體內(nèi),是近年來人類食用海產(chǎn)品后引起的腸道疾病的主要原因之一,其致病性已引起世界性的廣泛關(guān)注,對(duì)其致病機(jī)理的研究也越來越深入。過氧化氫酶(hydrogen peroxidase)又稱觸酶(catalase,CAT)是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)的末端抗氧化酶。過氧化氫酶常被廣泛用于醫(yī)學(xué)診斷、臨床分析、食品消毒、以及造紙、紡織、制漿等工業(yè)。本課題來源于在副溶血弧菌VP110基因組中發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶(catVPF1)及同工酶(catVPR2)。為研究這兩種過氧化氫酶的活性以及過氧化氫酶在VP110體內(nèi)的作用,利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白后通過試劑盒檢測(cè)目的蛋白的比酶活,同時(shí)利用over-lap PCR方法設(shè)計(jì)敲除過氧化氫酶基因,觀察各表型菌株的抗氧化能力以及生長(zhǎng)狀況。利用RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)在過氧化氫的培養(yǎng)基中過氧化氫酶基因表達(dá)量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,副溶血弧菌過氧化氫酶在大腸桿菌中能有效表達(dá),catVPF1測(cè)定結(jié)果為242.02 IU/mg,catVPR2測(cè)定結(jié)果為197.962 IU/mg。攜帶過氧化氫酶基因的副溶血弧菌菌株對(duì)氧化劑有一定抗性,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)野生型菌株比過氧化氫酶基因缺失菌株抗氧化能力較強(qiáng);單過氧化氫酶基因缺失菌株比雙基因缺失菌株抗氧化能力強(qiáng)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在無氧環(huán)境下,隨著過氧化氫濃度的增加過氧化氫酶基因表達(dá)總體下調(diào);在有氧環(huán)境一定過氧化氫濃度下,過氧化氫酶基因表達(dá)量會(huì)隨著過氧化氫的濃度升高而表達(dá)上調(diào)。當(dāng)過氧化氫濃度過高時(shí),過氧化氫酶基因表達(dá)受到抑制。綜上所述,副溶血弧菌體內(nèi)過氧化氫酶對(duì)菌的生長(zhǎng)有一定的影響,可以使其在氧化環(huán)境中存活能力得到提高。
【關(guān)鍵詞】：副溶血弧菌 過氧化氫酶 酶活力 基因敲除 RT-PCR
【學(xué)位授予單位】：湖北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;S941.4
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 前言10-16
• 1.1 副溶血弧菌的研究進(jìn)展10-13
• 1.1.1 副溶血弧菌的生長(zhǎng)特性10-11
• 1.1.2 副溶血弧菌致病機(jī)理和主要毒力因子11-12
• 1.1.3 預(yù)防副溶血弧菌感染方法12
• 1.1.4 副溶血弧菌研究現(xiàn)狀12-13
• 1.2 過氧化氫酶的研究進(jìn)展13-14
• 1.2.1 過氧化氫酶的來源13-14
• 1.2.2 過氧化氫酶的應(yīng)用14
• 1.3 本課題的研究目的和創(chuàng)新14-16
• 第二章 過氧化氫酶cat VPF1和cat VPR2的克隆和重組菌的構(gòu)建16-26
• 2.1 材料16-17
• 2.1.1 菌株及培養(yǎng)條件16
• 2.1.2 質(zhì)粒16-17
• 2.2 常用緩沖液17
• 2.3 分子試劑17-18
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法18-22
• 2.4.1 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的制備及提取18
• 2.4.2 細(xì)菌基因組DNA的制備18-19
• 2.4.3 質(zhì)粒DNA的操作19
• 2.4.4 表達(dá)載體構(gòu)建19-20
• 2.4.5 感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化20-21
• 2.4.6 重組菌的篩選與鑒定21-22
• 2.4.7 菌種保藏與測(cè)序22
• 2.5 結(jié)果22-25
• 2.5.1 副溶血弧菌基因組的提取22-23
• 2.5.2 PCR擴(kuò)增cat基因及純化23-24
• 2.5.3 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建24
• 2.5.4 重組菌的鑒定結(jié)果24-25
• 2.5.5 菌種保藏測(cè)序25
• 2.6 討論25-26
• 第三章 過氧化氫酶cat VPF1和cat VPR2的表達(dá)條件優(yōu)化和活性測(cè)定26-37
• 3.1 常用試劑26
• 3.1.1 蛋白純化緩沖液26
• 3.1.2 其他常用試劑26
• 3.2 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)純化及定量26-29
• 3.2.1 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)26-27
• 3.2.2 目的蛋白純化27
• 3.2.3 SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純化效果27-28
• 3.2.4 蛋白含量的測(cè)定28-29
• 3.3 蛋白酶活力的測(cè)定29-30
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-35
• 3.4.1 SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白誘導(dǎo)及純化效果30-31
• 3.4.2 蛋白濃度測(cè)定結(jié)果31-33
• 3.4.3 過氧化氫蛋白酶活測(cè)定33-34
• 3.4.4 蛋白表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果34-35
• 3.5 討論35-37
• 第四章 cat基因缺失菌株的構(gòu)建與鑒定37-43
• 4.1 試驗(yàn)材料和方法37-40
• 4.1.1 試驗(yàn)材料37
• 4.1.2 目的基因敲除和回補(bǔ)37-38
• 4.1.3 缺失菌的構(gòu)建38-39
• 4.1.4 回補(bǔ)菌的構(gòu)建39-40
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-42
• 4.2.1 基因敲除與缺失菌株的構(gòu)建40-41
• 4.2.2 缺失菌株的鑒定41-42
• 4.3 討論42-43
• 第五章 野生型菌株與突變體菌株的生長(zhǎng)特性研究43-52
• 5.1 基因缺失菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定43-45
• 5.1.1 材料與方法43
• 5.1.2 結(jié)果43-45
• 5.1.3 討論45
• 5.2 各表型菌在氧化環(huán)境下生長(zhǎng)特性研究45-48
• 5.2.1 濾紙片法測(cè)定各表型菌在過氧化氫存在下的抑菌圈45-46
• 5.2.2 各表型菌抑菌圈結(jié)果與分析46-48
• 5.3 各表型菌在不同過氧化物環(huán)境下生長(zhǎng)狀況探究48-51
• 5.3.1 各表型弧菌在高濃度過氧化氫環(huán)境中的生長(zhǎng)狀況48-49
• 5.3.2 各表型弧菌在高濃度異丙苯環(huán)境中的生長(zhǎng)狀況49-50
• 5.3.3 各表型弧菌在高濃度的叔丁基過氧化氫環(huán)境中生長(zhǎng)狀況50-51
• 5.4 結(jié)論與分析51-52
• 第六章 cat在氧化脅迫下對(duì)副溶血弧菌VP110基因的調(diào)控52-62
• 6.1 材料與方法52-53
• 6.1.1 試驗(yàn)材料52
• 6.1.2 細(xì)菌RNA提取和反轉(zhuǎn)錄52-53
• 6.2 有氧環(huán)境下cat在氧化脅迫下對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控53-55
• 6.2.1 副溶血弧菌總RNA提取與定量53-54
• 6.2.2 基因組DNA的去除及c DNA的合成54
• 6.2.3 RT-PCR54-55
• 6.3 無氧環(huán)境下cat在氧化脅迫下對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控55-56
• 6.3.1 無氧環(huán)境氧化脅迫下副溶血弧菌總RNA提取與定量55
• 6.3.2 基因組DNA的去除及c DNA的合成55-56
• 6.3.3 q PCR56
• 6.4 結(jié)果與分析56-62
• 6.4.1 有氧環(huán)境氧化脅迫下副溶血弧菌VP110總RNA的提取56-57
• 6.4.2 Real-Time PCR方法檢測(cè)cat基因在有氧環(huán)境氧化脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平57-59
• 6.4.3 無氧環(huán)境下副溶血弧菌VP110總RNA的提取59
• 6.4.4 Real-Time PCR方法檢測(cè)cat基因在無氧環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄水平59-62
• 第七章 總結(jié)與討論62-63
• 致謝63-64
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 附錄一 攻讀碩士期間發(fā)表論文目錄71-72
• 縮略語表72

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王瑞蘭,易俗,王映,陳康貴,蔡振民,何文星;鈾尾礦對(duì)水稻種子萌發(fā)率及幼苗過氧化氫酶的影響[J];農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào);2004年02期

2 劉冰,梁嬋娟;生物過氧化氫酶研究進(jìn)展[J];中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào);2005年05期

3 鄧向軍;余筱潔;;蘋果過氧化氫酶的純化及性質(zhì)研究[J];食品科技;2006年11期

4 王志華;沈良;;錳過氧化氫酶及其模擬物的研究進(jìn)展[J];杭州師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2006年06期

5 錢斯亮;蔡宇杰;廖祥儒;沈微;吳亢;張峰;張大兵;;熱穩(wěn)定性過氧化氫酶高產(chǎn)菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2008年02期

6 張東旭;堵國(guó)成;陳堅(jiān);;微生物過氧化氫酶的發(fā)酵生產(chǎn)及其在紡織工業(yè)的應(yīng)用[J];生物工程學(xué)報(bào);2010年11期

7 劉冬;季石美;汪成富;;過氧化氫酶優(yōu)良基因菌株的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年35期

8 孔德勝;王曉然;李文君;陳永春;姚敏;高媛;;小鼠組織中過氧化氫酶的活性與年齡的關(guān)系[J];生物學(xué)雜志;2012年03期

9 陳添福;Suparman Widodo;;豚鼠試驗(yàn),過氧化氫酶/過氧化物酶試驗(yàn)與耐異菸肼結(jié)核菌間的關(guān)系[J];微生物學(xué)報(bào);1963年01期

10 馬炳章;林哲浦;;花生過氧化氫酶的初步研究[J];植物生理學(xué)通訊;1964年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 劉貴忠;柳永亮;劉漢平;王吉華;;交變電場(chǎng)對(duì)過氧化氫酶吸收光譜的影響[A];第七屆全國(guó)光生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2010年

2 簡(jiǎn)嘉;李平華;;過氧化氫酶與甲基強(qiáng)的松龍對(duì)實(shí)驗(yàn)性脫髓鞘性視神經(jīng)炎的抑制作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)眼科學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2007年

3 冷曬祥;華兆哲;堵國(guó)成;陳堅(jiān);;紡織清潔生產(chǎn)用過氧化氫酶發(fā)酵生產(chǎn)條件及酶學(xué)性質(zhì)[A];第七屆功能性紡織品及納米技術(shù)應(yīng)用研討會(huì)論文集[C];2007年

4 史紅霞;陸天虹;黃曉華;;稀土Eu~(3+)與過氧化氫酶的相互作用研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第26屆學(xué)術(shù)年會(huì)化學(xué)生物分會(huì)場(chǎng)論文集[C];2008年

5 周立祥;毛為民;;過氧化氫酶TF-160的應(yīng)用性能[A];傳化杯第七屆全國(guó)染整前處理學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2007年

6 張江;劉宏;譙仕彥;;過氧化氫酶在乳酸菌的表達(dá)及其在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中的作用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)分會(huì)第十一次全國(guó)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2012年

7 苗升浩;孫秀發(fā);應(yīng)晨江;;蝦青素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞過氧化氫酶和SOD-1表達(dá)的影響[A];湖北省、武漢市營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)第十屆學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

8 李偉;;Abelson相關(guān)蛋白與過氧化氫酶相互作用機(jī)制的初步研究[A];中國(guó)生物工程學(xué)會(huì)第三次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2001年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 謝紋;過氧化氫酶對(duì)棉染色的影響[N];中國(guó)紡織報(bào);2004年

2 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院;海水中細(xì)菌過氧化氫酶多樣性可精確快速檢測(cè)[N];中國(guó)漁業(yè)報(bào);2014年

3 劉國(guó)信;固定化過氧化氫酶對(duì)生牛奶的保鮮研究[N];中國(guó)畜牧報(bào);2004年

4 遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司;過氧化氫酶(CAT)的存在及生物活性[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2014年

5 張東旭 華兆哲;《堿性果膠酶發(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用研究》、《過氧化氫酶發(fā)酵生產(chǎn)及應(yīng)用研究》通過專家驗(yàn)收[N];中國(guó)紡織報(bào);2005年

6 人民教育出版社生物編輯室 劉真;一句話的來歷[N];中國(guó)教育報(bào);2000年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 史訓(xùn)龍;重組表達(dá)過氧化氫酶及抗氧化損傷生物活性的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

2 王群英;過氧化氫酶對(duì)腸上皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

3 施志慧;人源過氧化氫酶的重組穩(wěn)定表達(dá)、PEG修飾和抗病毒性肺炎作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

4 王偉;南極海洋微生物N2a鑒定、系統(tǒng)學(xué)及一種低溫過氧化氫酶BNC純化與性質(zhì)研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2008年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李斌斌;過氧化氫酶基因多態(tài)性在運(yùn)動(dòng)員選材中應(yīng)用的可行性研究[D];江西師范大學(xué);2015年

2 王慧;錳過氧化氫酶基因的表達(dá)與優(yōu)化[D];石河子大學(xué);2015年

3 范文鋒;生物酶在人發(fā)脫色過程中的技術(shù)研究[D];山東理工大學(xué);2015年

4 于德玲;青島文昌魚過氧化氫酶基因的克隆與表達(dá)研究[D];魯東大學(xué);2016年

5 楊寧;重組副溶血弧菌過氧化氫酶catVPF1，，catVPR2的克隆表達(dá)及基因功能研究[D];湖北師范大學(xué);2016年

6 姚海勇;Bacillus subtilis WSHDZ-01產(chǎn)過氧化氫酶的提取、純化及性質(zhì)研究[D];江南大學(xué);2008年

7 張心齊;堿性過氧化氫酶產(chǎn)生菌的篩選及其酶的分離純化與性質(zhì)研究[D];江南大學(xué);2004年

8 賀仁艷;檸檬酸對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)過氧化氫酶的影響及其機(jī)理[D];江南大學(xué);2012年

9 王明星;紡織用堿性耐熱過氧化氫酶的微生物法生產(chǎn)及保存穩(wěn)定性的研究[D];江南大學(xué);2005年

10 宋傳濤;六價(jià)鉻離子對(duì)金鯽魚外周血細(xì)胞微核量和過氧化氫酶的影響[D];吉林大學(xué);2006年

  本文關(guān)鍵詞：重組副溶血弧菌過氧化氫酶catVPF1，catVPR2的克隆表達(dá)及基因功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：407456