本文關(guān)鍵詞：柳枝稷Pvi-miR319基因及其靶基因PvPCF5的克隆與功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：柳枝稷(Panicum virgatum L.)是一類(lèi)暖季型的多年生草,最早生長(zhǎng)在北美地區(qū),屬于禾本科黍?qū)佟＝陙?lái)柳枝稷由于較高的產(chǎn)量,良好的生態(tài)效益,對(duì)貧瘠土壤廣泛的適應(yīng)性以及較高的纖維素含量等優(yōu)良特征而受到高度的關(guān)注。大量的研究表明,miRN As及其靶基因在植物自身發(fā)育,營(yíng)養(yǎng)平衡和多種多樣的環(huán)境脅迫響應(yīng)機(jī)制中扮演著至關(guān)重要的角色。然而,在模式能源植物柳枝稷中,miRN As的特性及其生物調(diào)控功能卻鮮有報(bào)道。在本研究中,作者根據(jù)水稻的Osa-miR319a的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列信息,克隆并鑒定了一個(gè)柳枝稷中的miR319基因即Pvi-miR319a。通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻,成功獲得并鑒定了21個(gè)Pvi-miR319a基因過(guò)量表達(dá)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻株系。與野生型水稻相比,大部分的轉(zhuǎn)基因株系的葉片明顯變寬,葉色變深,植株生長(zhǎng)嚴(yán)重推遲,且兩大葉脈間的小葉脈數(shù)量的平均值顯著增加。此外,作者也克隆并鑒定了一個(gè)柳枝稷中的Pvi-miR319a的預(yù)測(cè)靶基因PvPCF5,該基因共編碼444個(gè)氨基酸。經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及多重序列比對(duì)分析表明,該基因編碼的蛋白PvPCF5屬于TCP轉(zhuǎn)錄因子家族成員,并且在N端包含有一個(gè)保守的TCP結(jié)構(gòu)域,其C端含有一段Pvi-miR319a的成熟序列互補(bǔ)區(qū)段。通過(guò)空間表達(dá)分析顯示該基因在成熟穗中具有最高的表達(dá)量,而Pvi-miR319a則是在幼穗中的表達(dá)水平最高。之后根據(jù)煙草葉片的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示基因PvPCF5可以被Pvi-miR319a負(fù)調(diào)控表達(dá),表明柳枝稷中的PvPCF5基因是Pvi-miR319a的一個(gè)靶基因。作者又通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活及亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)對(duì)該基因進(jìn)行功能驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)表明PvPCF5是一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄激活活性的核定位蛋白,并且驗(yàn)證該蛋白的前段(1-299aa)起主要的轉(zhuǎn)錄激活作用。綜上所述,我們推測(cè)Pvi-miR319a及其靶基因PvPCF5可能是一對(duì)重要的調(diào)節(jié)因子,主要參與植物葉片發(fā)育,營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)等過(guò)程,在今后柳枝稷的遺傳改良中將發(fā)揮更大的潛力。
【關(guān)鍵詞】：柳枝稷 MiR319 TCP轉(zhuǎn)錄因子 葉片形態(tài)
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 縮略詞6-11
• 1 引言11-24
• 1.1 柳枝稷的形態(tài)特征及應(yīng)用11-12
• 1.2 MicroRNA研究進(jìn)展12-14
• 1.2.1 MicroRNAs的發(fā)現(xiàn)12-13
• 1.2.2 MiRNAs在植物中的研究進(jìn)展13-14
• 1.3 MiRNAs生物合成及作用機(jī)制14-16
• 1.3.1 MiRNA基因的轉(zhuǎn)錄和加工14
• 1.3.2 MiRNA進(jìn)入到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體14
• 1.3.3 MiRNAs調(diào)控基因表達(dá)的方式14-15
• 1.3.4 MiRNAs靶基因及預(yù)測(cè)15-16
• 1.4 植物miRNAs的功能16-18
• 1.4.1 miRNAs參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育16-17
• 1.4.2 miRNAs參與調(diào)控植物脅迫應(yīng)答機(jī)制17-18
• 1.5 MiRNA319研究進(jìn)展18-21
• 1.5.1 MiR319靶基因的鑒定18-19
• 1.5.2 MiRNA319及靶基因的生物學(xué)功能19-21
• 1.6 研究?jī)?nèi)容及技術(shù)路線(xiàn)21-24
• 1.6.1 研究?jī)?nèi)容21-23
• 1.6.2 技術(shù)路線(xiàn)23-24
• 2 柳枝稷miRNA319基因的克隆與表達(dá)24-31
• 2.1 材料與試劑24
• 2.1.2 植物材料24
• 2.1.3 生物試劑24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-28
• 2.2.1 柳枝稷的培養(yǎng)方法24
• 2.2.2 總RNA提取及cDNA合成24-26
• 2.2.3 柳枝稷基因組DNA提取26
• 2.2.4 PCR擴(kuò)增26-27
• 2.2.5 目的片段的測(cè)序27-28
• 2.2.6 Pvi-mi319基因的時(shí)空表達(dá)分析28
• 2.3 結(jié)果與分析28-30
• 2.3.1 Pvi-miR319a基因的同源克隆28-30
• 2.3.2 Pvi-miR319a的空間表達(dá)分析30
• 2.4 討論30-31
• 3 柳枝稷Pvi-miR319a基因在水稻中的異位表達(dá)及表型分析31-41
• 3.1 植物材料31
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法31-34
• 3.2.1 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建31-33
• 3.2.2 轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)33-34
• 3.2.3 轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定34
• 3.3 結(jié)果與分析34-40
• 3.3.1 Pvi-miR319a過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定34-38
• 3.3.2 過(guò)量表達(dá)Pvi-miR319a基因?qū)е罗D(zhuǎn)基因水稻多種表型變化38-40
• 3.4 討論40-41
• 4 Pvi-miR319a基因的靶基因預(yù)測(cè)及功能鑒定41-55
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料41
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法41-45
• 4.2.1 qRT-PCR分析預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)情況41-42
• 4.2.2 PvPCF5的時(shí)空表達(dá)分析42
• 4.2.3 煙草的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)42
• 4.2.4 PvPCF5的生物信息學(xué)分析42-43
• 4.2.5 質(zhì)粒大提(選用Qiagen公司質(zhì)粒大提試劑盒)43
• 4.2.6 亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)43-44
• 4.2.7 轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)44-45
• 4.3 結(jié)果與分析45-54
• 4.3.1 轉(zhuǎn)基因植株中Pvi-miR319a預(yù)測(cè)靶基因的表達(dá)分析45-46
• 4.3.2 PvPCF5基因的鑒定及表達(dá)模式分析46-48
• 4.3.3 煙草瞬時(shí)表達(dá)證明PvPCF5是Pvi-miR319a的靶基因48-49
• 4.3.4 柳枝稷PvPCF5基因編碼了一個(gè)TCP轉(zhuǎn)錄因子蛋白49-54
• 4.4 討論54-55
• 5 結(jié)論與展望55-57
• 5.1 結(jié)論55
• 5.2 展望55-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 個(gè)人簡(jiǎn)介63-64
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介64-65
• 獲得成果目錄65-66
• 致謝66

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