轉(zhuǎn)錄激活因子3(ATF3)是一種早期應(yīng)激反應(yīng)基因,能夠影響細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)是重組蛋白、單克隆抗體等生物大分子藥物生產(chǎn)的主要宿主細(xì)胞之一。ATF3能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及抗凋亡等作用,理論上可對(duì)CHO細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。因此本試驗(yàn)對(duì)CHO細(xì)胞中ATF3的甲基化水平進(jìn)行深入研究,通過(guò)重亞硫酸鹽測(cè)序法檢測(cè)CHO-K1細(xì)胞中ATF3的甲基化水平,發(fā)現(xiàn)ATF3啟動(dòng)子區(qū)域的胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤(CpG)甲基化高達(dá)90%。為了進(jìn)一步研究ATF3甲基化的上游調(diào)控機(jī)制,構(gòu)建了敲除DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)的CHO-K1來(lái)研究DNMT3A對(duì)ATF3甲基化水平的影響。結(jié)果表明,敲除DNMT3A后,CHO-K1細(xì)胞中的ATF3甲基化水平降低至0,這充分證明了DNMT3A對(duì)ATF3的甲基化的調(diào)控作用,為CHO細(xì)胞的ATF3基因調(diào)控研究以及后續(xù)CHO細(xì)胞株改造提供了理論依據(jù)。

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【文章目錄】：
1材料與試劑
    1.1細(xì)胞及質(zhì)粒
    1.2 酶及抗體
    1.3 試劑盒
    1.3 試劑
    1.4 培養(yǎng)基
    1.5 引物合成及檢測(cè)分析
2 方法與結(jié)果
    2.1 培養(yǎng)基的配制
    2.2 構(gòu)建DNMT3A敲除細(xì)胞株
        2.2.1 小向?qū)NA的設(shè)計(jì)以及Crispr/Cas9系統(tǒng)敲除載體的構(gòu)建
        2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
        2.2.3 單克隆細(xì)胞株的篩選和檢測(cè)鑒定
    2.3 ATF3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化檢測(cè)
3 討論



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