利用啟動子組織表達(dá)定位、超表達(dá)及CRISPR/Cas9基因敲除等方法對蒺藜苜蓿酸性磷酸酶MtPAP3基因的功能進(jìn)行研究。結(jié)果顯示:MtPAP3在蒺藜苜蓿根和根瘤的維管束組織以及根瘤的分生區(qū)和侵染區(qū)中表達(dá),在低磷脅迫和根瘤中均表現(xiàn)為特異性誘導(dǎo)后的高效表達(dá);超表達(dá)MtPAP3能夠顯著提高蒺藜苜蓿的結(jié)瘤數(shù)及根瘤固氮酶活,敲除MtPAP3基因能顯著抑制根瘤的發(fā)育及固氮酶活。結(jié)果表明:MtPAP3參與低磷脅迫條件下根瘤中的磷代謝及共生固氮過程。

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圖1MtPAP3系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用NCBI和Uniprot數(shù)據(jù)庫分析可知,蒺藜苜蓿酸性磷酸酶基因MtPAP3(medtr6g013050)全長4132bp,其中編碼區(qū)1689bp,編碼587個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),分子質(zhì)量為66.16ku,PI值為6.14。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示MtPAP3蛋白含有特異的金....

圖2低磷處理下MtPAP3在根和根瘤中的轉(zhuǎn)錄水平

為了驗(yàn)證MtPAP3是否參與植物應(yīng)對低磷脅迫且參與蒺藜苜蓿根瘤中的磷代謝,分別收取磷饑餓處理7d后的根和磷饑餓處理21d后的根瘤樣品,抽取RNA,進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果顯示:MtPAP3在低磷(5μmol/LKH2PO4)脅迫根中的表達(dá)量是高磷處理下根中的14.68倍....

圖3MtPAP3在蒺藜苜蓿根瘤中的時空表達(dá)

為了進(jìn)一步探究MtPAP3是否與根瘤的發(fā)育相關(guān),隨機(jī)挑選接菌28d后空載體植株、MtPAP3超表達(dá)植株和MtPAP3敲除植株根部5～10個根瘤,用FAA固定液進(jìn)行包埋、縱切、苯胺藍(lán)染色,置于體式光學(xué)顯微鏡下觀察(圖8)。結(jié)果顯示:與空載體對照植株相比,超表達(dá)植株根瘤固氮區(qū)含菌細(xì)....

圖4MtPAP3超表達(dá)植株的結(jié)瘤表型

圖3MtPAP3在蒺藜苜蓿根瘤中的時空表達(dá)圖5MtPAP3超表達(dá)和對照植株共生表型測定

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