紅霉素A(Erythromycin A,ErA)是紅色糖多孢菌在次級代謝過程中合成產生的一類大環(huán)內酯類抗生素,具有日益增長的臨床應用需求。因此,利用基因工程技術改造宿主菌,獲得高產菌株,提高其工業(yè)產量仍是其研究的重中之重。隨著新型基因組編輯技術的發(fā)展,改造合成基因簇、調控基因表達等干擾策略越來越受到研究人員的重視。紅色糖多孢菌屬于高GC含量的放線菌,基于傳統(tǒng)的同源雙交換原理的基因編輯技術效率低、操作周期長,嚴重限制了紅色糖多孢菌基因改造的進程。對于紅霉素A等次級代謝產物產量的提高則需要一種更為高效的基因編輯工具。CRISPR-Cas9系統(tǒng)廣泛應用于許多物種的基因編輯,在放線菌屬的天藍色鏈霉菌中已經有基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術,但是紅色糖多孢菌中缺乏有效的CRISPR-Cas9編輯工具。本研究應用CRISPR-Cas9高效基因編輯系統(tǒng)對紅色糖多孢菌進行基因工程改造,包括敲入組成型強啟動子、定點整合增加前體合成的酶,CRISPRi優(yōu)化代謝流,構建并篩選得到紅霉素A高產工業(yè)菌株。本研究率先開發(fā)了應用于紅色糖多孢菌的CRISPR-Cas9基因編輯技術。主要研究內容如下:應用CRI...

【文章頁數】：172 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

圖１．１通過雙鏈斷裂進行基因編輯｜ｉｅ｜??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｇｅｎｏｍｅ?Ｅｄｉｔｉｎｇ?Ｕｓｉｎｇ?Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ?Ｂｒｅａｋｓ??（Ａ）?Ａ?ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ?ｎｕｃｌｅａｓｅ?ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｓ?ａ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ＤＳＢ?ｉｎ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ．?（Ｂ）?ＺＦＮｓ，??

發(fā)成一種高效的基因編輯工具。其??中ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系統(tǒng)是研宄最深入，應用最成熟的一種類別，目前為第三代基因??組定點編輯技術［４’５１。與前兩代的ＺＦＮ?（Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｎｕｃｌｅａｓｅ，鋅指核酸酶）＊］和??ＴＡＬＥＮ?（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ａｃｔｉｖ....

圖１．６聚酮生物合成基因簇Ｉ１２３！??Ｆｉｇｕｒｅ?１．６?Ｇｅｎｅ?Ｃｌｕｓｔｅｒｓ?ｆｏｒ?Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ?Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ??ａｂｃ＼?ＡＢＣ?

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圖１．７?ＤＥＢＳ模塊的氨基酸序列比對序列｜１３２?

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圖１．９?Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ?Ａ生物合成途徑Ｉ１２４１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．９?Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?Ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ?Ａ??

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