紅霉素A(Erythromycin A,ErA)是紅色糖多孢菌在次級(jí)代謝過程中合成產(chǎn)生的一類大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,具有日益增長(zhǎng)的臨床應(yīng)用需求。因此,利用基因工程技術(shù)改造宿主菌,獲得高產(chǎn)菌株,提高其工業(yè)產(chǎn)量仍是其研究的重中之重。隨著新型基因組編輯技術(shù)的發(fā)展,改造合成基因簇、調(diào)控基因表達(dá)等干擾策略越來越受到研究人員的重視。紅色糖多孢菌屬于高GC含量的放線菌,基于傳統(tǒng)的同源雙交換原理的基因編輯技術(shù)效率低、操作周期長(zhǎng),嚴(yán)重限制了紅色糖多孢菌基因改造的進(jìn)程。對(duì)于紅霉素A等次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的提高則需要一種更為高效的基因編輯工具。CRISPR-Cas9系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于許多物種的基因編輯,在放線菌屬的天藍(lán)色鏈霉菌中已經(jīng)有基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù),但是紅色糖多孢菌中缺乏有效的CRISPR-Cas9編輯工具。本研究應(yīng)用CRISPR-Cas9高效基因編輯系統(tǒng)對(duì)紅色糖多孢菌進(jìn)行基因工程改造,包括敲入組成型強(qiáng)啟動(dòng)子、定點(diǎn)整合增加前體合成的酶,CRISPRi優(yōu)化代謝流,構(gòu)建并篩選得到紅霉素A高產(chǎn)工業(yè)菌株。本研究率先開發(fā)了應(yīng)用于紅色糖多孢菌的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)。主要研究?jī)?nèi)容如下:應(yīng)用CRI...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

圖１．１通過雙鏈斷裂進(jìn)行基因編輯｜ｉｅ｜??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｇｅｎｏｍｅ?Ｅｄｉｔｉｎｇ?Ｕｓｉｎｇ?Ｄｏｕｂｌｅ－Ｓｔｒａｎｄｅｄ?Ｂｒｅａｋｓ??（Ａ）?Ａ?ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ?ｎｕｃｌｅａｓｅ?ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｓ?ａ?ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ＤＳＢ?ｉｎ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ．?（Ｂ）?ＺＦＮｓ，??

發(fā)成一種高效的基因編輯工具。其??中ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系統(tǒng)是研宄最深入，應(yīng)用最成熟的一種類別，目前為第三代基因??組定點(diǎn)編輯技術(shù)［４’５１。與前兩代的ＺＦＮ?（Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ?ｎｕｃｌｅａｓｅ，鋅指核酸酶）＊］和??ＴＡＬＥＮ?（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ?ａｃｔｉｖ....

圖１．６聚酮生物合成基因簇Ｉ１２３！??Ｆｉｇｕｒｅ?１．６?Ｇｅｎｅ?Ｃｌｕｓｔｅｒｓ?ｆｏｒ?Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ?Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ??ａｂｃ＼?ＡＢＣ?

Ｐｋｓ４?０?１０?２０?ｋｂ??１?ｉ?ｉ??ｃｐｓ??ｔｅ?ｏｘｙ?ｏｘｙ?ｐｋｓ５－２?ｐｋｓ５－１?ａｃｐ?ｒｅｇ??０?１０?２０?ｋｂ??ａｃｐ?ｈｍｇ?ｄｈ??ｋｓｌｌｌ?ａｃｐ?ｄｈ?ｋｓ?ｋｓｃｕｐ?ｒｅｇ??０?１０?２０?ｋｂ??１?ｉ?ｉ??ｐｋｓ７－１?....

圖１．７?ＤＥＢＳ模塊的氨基酸序列比對(duì)序列｜１３２?

ＩＲＷ?ＡＱＲＵ＾ＬＳＰＤＥ?ＡＱＨｌ＾＾｜ＶＣＤＡＯ??ＤＥＢＳ＿ｍ４?ＤＥＳｇ＾＾ＶＧＩ?ＨＶＩ＾＾ＡＥＱ?－－Ｋ?國(guó)關(guān)＿ＣＱＣ?Ａ＾ＶＨＣＶ＾ＡＤＬ?ＶＤＲＬＡＧＲ｜ＥＳＤ?ＡＥＨ？Ｕ）ＲＬ：「ＡＡＳＰ??ＤＥＢＳ?ｍ５?ＲＡＣｉＳ＾＠＾ＣＭ?ＨＶＩ＾＾ＥＡＤ?－－〇Ｗｙ？....

圖１．９?Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ?Ａ生物合成途徑Ｉ１２４１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．９?Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?Ｐａｔｈｗａｙ?ｏｆ?Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ?Ａ??

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