外源DNA片段的拷貝數(shù)及插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列等分子特征信息是轉(zhuǎn)基因植物安全評(píng)價(jià)過(guò)程中必需要提供的信息。本研究利用基因組測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)耐除草劑轉(zhuǎn)基因水稻G2-7的T-DNA插入位點(diǎn)、拷貝數(shù)和側(cè)翼序列進(jìn)行鑒定。利用Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)對(duì)G2-7進(jìn)行全基因組測(cè)序,共獲得47.13 Gb的測(cè)序數(shù)據(jù),通過(guò)與轉(zhuǎn)基因載體和參考基因組序列的比較,確定了G2-7中T-DNA在受體基因組中的插入位點(diǎn)。結(jié)果顯示,外源DNA片段以單位點(diǎn)單拷貝形式插入到水稻1號(hào)染色體的36,189,491～36,189,507位置,造成水稻基因組16bpDNA缺失,無(wú)載體骨架的插入。同時(shí)我們獲得外源基因插入位點(diǎn)5′側(cè)翼序列375 bp和3′端側(cè)翼序列353 bp,并通過(guò)PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序進(jìn)一步證明獲得的側(cè)翼序列是正確的。研究結(jié)果為轉(zhuǎn)基因水稻G2-7的安全評(píng)價(jià)及轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)提供了有效的數(shù)據(jù)支撐,同時(shí)也證明全基因組測(cè)序(WGS)是解析轉(zhuǎn)基因植物分子特征的有效方法。

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圖1G2-7中外源插入片段與受體基因組結(jié)合位點(diǎn)分析(部分結(jié)合區(qū)序列的比對(duì)結(jié)果)

為了明確是否有載體骨架插入,本研究分析測(cè)序數(shù)據(jù)與載體骨架序列的匹配情況,發(fā)現(xiàn)G2-7中匹配到載體骨架的讀序有3條,分別定位在載體參考序列的171～233、4576～4725和4586～4735位置,ZH11-p中完全匹配到載體骨架區(qū)的讀序有35,163條,ZH11中匹配到載體骨架....

圖2測(cè)序數(shù)據(jù)與質(zhì)粒DNA比對(duì)結(jié)果的可視化

圖1G2-7中外源插入片段與受體基因組結(jié)合位點(diǎn)分析(部分結(jié)合區(qū)序列的比對(duì)結(jié)果)2.3外源基因在受體基因組中的整合位點(diǎn)及側(cè)翼序列分析

圖3載體骨架匹配讀序的PCR驗(yàn)證

將G2-7中匹配到結(jié)合區(qū)序列用SOAPdenovo進(jìn)行拼接,獲得了插入位點(diǎn)處3′端接合區(qū)序列780bp和5′端接合區(qū)序列823bp。其中,3′端接合區(qū)有353bp為水稻基因組序列,有427bp為T-DNA序列,T-DNA序列在3′端缺失42bp;5′端接合區(qū)序列有375....

圖4外源DNA片段在受體基因組中的整合位點(diǎn)及側(cè)翼序列分析

圖3載體骨架匹配讀序的PCR驗(yàn)證2.4側(cè)翼序列的Sanger測(cè)序驗(yàn)證

本文編號(hào)：3948511