采用qRT–PCR技術(shù)分析水稻OsRZFP34在高溫(42℃)、低溫(4℃)、10%聚乙二醇(PEG)6000模擬干旱、高鹽(100 mmol/L NaCl)和脫落酸(ABA)處理(100μmol/L)下的表達(dá)模式;克隆OsRZFP34基因啟動子,并利用在線軟件New PLACE和PlantCARE對其序列進(jìn)行順式作用元件分析;構(gòu)建OsRZFP34pro::GUS表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化水稻;通過組織化學(xué)染色和GUS酶活性檢測,分析在不同脅迫處理條件下OsRZFP34啟動子驅(qū)動GUS基因表達(dá)的活性。qRT–PCR分析結(jié)果表明,上述5種處理均能不同程度地誘導(dǎo)OsRZFP34的表達(dá),其中高溫脅迫對其表達(dá)的誘導(dǎo)程度最強(qiáng),而ABA對其表達(dá)只有微弱的誘導(dǎo)。順式作用元件分析結(jié)果表明,該啟動子上包含有多個與逆境響應(yīng)、激素響應(yīng)以及Ca²⁺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)元件。GUS組織化學(xué)染色和熒光分析結(jié)果顯示,OsRZFP34基因啟動子的活性受到高溫、低溫、PEG、鹽和ABA的調(diào)控,表明該啟動子是受多種逆境誘導(dǎo)的誘導(dǎo)型啟動子。

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圖1OsRZFP34pro::GUS植物表達(dá)載體構(gòu)建示意結(jié)果

利用EasyGeno快速重組克隆試劑盒將回收的PCR產(chǎn)物與經(jīng)KpnⅠ和NcoⅠ線性化的pCAMBIA–1305.1載體進(jìn)行基因重組，用OsRZFP34啟動子替換35S啟動子，構(gòu)建OsRZFP34pro::GUS植物表達(dá)載體(圖1)。重組子分別用KpnⅠ+BglⅡ和KpnⅠ....

圖2OsRZFP34在水稻不同組織和不同脅迫處理下的相對表達(dá)量

利用qRT–PCR檢測了OsRZFP34受不同脅迫處理誘導(dǎo)表達(dá)的情況。結(jié)果顯示，高溫(42℃)、低溫(4℃)、模擬干旱(10%PEG6000)、高鹽(100mmol/LNaCl)和ABA(100μmol/L)處理均能不同程度地誘導(dǎo)OsRZFP34的表達(dá)，其中，高溫脅迫....

圖3OsRZFP34啟動子擴(kuò)增及重組載體酶切檢測結(jié)果

以水稻基因組DNA為模板，OsRZFP34–PF/R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示，在接近2000bp區(qū)域出現(xiàn)單一清晰條帶，大小與預(yù)期一致(圖3–A)。采用無縫重組試劑盒(EasyGeno)將純化的目的片段連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA–1305.1上。重組質(zhì)....

圖4OsRZFP34pro::GUS轉(zhuǎn)基因水稻不同組織的GUS染色結(jié)果

取非脅迫條件下生長的OsRZFP34pro::GUS轉(zhuǎn)基因水稻的根、莖、葉片、葉枕、穎花和種子進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，結(jié)果(圖4–G、H、I、J、K、L)顯示，只在葉片和葉枕部能夠觀察到微弱的藍(lán)色，說明在非脅迫條件下OsRZFP34啟動子活性很弱，在大多數(shù)組織中不表達(dá)。此結(jié)果....

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