西妥昔單抗和帕尼單抗是表皮生長因子受體抑制劑,此類靶向治療藥物的出現(xiàn),有效抑制了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展,但西妥昔單抗和帕尼單抗的治療受到EGFR下游RAS基因的影響,RAS突變型能自動活化通路并轉(zhuǎn)導(dǎo)下游信號,所以只有RAS野生型患者才能對EGFR單抗的治療產(chǎn)生良好效果。RAS突變中N-RAS突變僅占約2%,不容易受到研究重視,因此本文對N-RAS的突變檢測進(jìn)行研究。本文先通過N-RAS常見的17種突變位點,構(gòu)建了N-RAS突變型和野生型的質(zhì)粒,提取質(zhì)粒后通過電泳觀察條帶顏色,顏色較亮,用nanodrop檢測質(zhì)粒濃度結(jié)果為40ng/μL。測序驗證顯示模板DNA序列與合成序列一致。采用Taqman探針熒光定量PCR技術(shù),使用Primer Express 3.0軟件設(shè)計野生型和突變型引物及探針,經(jīng)過PCR反應(yīng)體系優(yōu)化后得出最佳反應(yīng)體系的條件,引物終濃度為0.4μΜ/μL,探針終濃度為0.2μΜ/μL,模板DNA終濃度為1ng/μL,并以此建立單引物熒光定量PCR反應(yīng)體系。單引物體系構(gòu)建完成后分別用單引物驗證其特異性,2號外顯子12號密碼子野生型模板熒光定量PCR的Ct值分別為:20.5456,2...

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1.1第一代基因測序原理

圖1.1第一代基因測序原理先由dNTP（短寡聚核苷酸）自身反應(yīng)之。之后用終止試劑（不含聚合酶的雙脫氧同大小的分子最終篩選分離。DNA模板后在DNA聚合酶作用下生成一部分均由一種ddNTP將其終止，后用所需序列讀出。

圖1.2延伸反應(yīng)分組示意圖

圖1.1第一代基因測序原理由圖1.1可知，首先由dNTP（短寡聚核苷酸）自身反應(yīng)之后被用作引物來導(dǎo)新DNA鏈的合成[5]。之后用終止試劑（不含聚合酶的雙脫氧核苷酸）對引物伸出大量不同形狀、不同大小的分子最終篩選分離。測序引物結(jié)合單鏈DNA模板后在DNA聚合酶....

圖1.3illumina測序原理

圖1.3illumina測序原理DNA待測文庫構(gòu)建出單鏈的DNA文庫前要將待測樣本DNA打斷成多個長度為200-，在這些小片段的兩端加上不同接頭。Flowcellcell以槽道的形式吸附流動的DNA片段，建立文庫后，DNA片段在隨機附著在其表面。每個F....

圖1.4Solid測序原理

齊魯工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文行下一輪測序反應(yīng)。這種測序技術(shù)每次只用添加一個dNTP的特點就可以很高同聚物長度的測量精度，此技術(shù)的主要測序誤差來自于堿基的替換%-1.5%之間[16]。ABI公司于2007年開始投入Solid測序技術(shù)[17]并開發(fā)此技術(shù)機器進(jìn)行商應(yīng)用。So....

本文編號：3925740