產(chǎn)甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes)是一株具有多重抗逆特性的工業(yè)二倍體酵母,是優(yōu)良的底盤細胞。但C.glycerinogenes的二倍體基因組、無有性生殖、缺乏選擇標記等限制了該菌的基因編輯效率。新一代基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)因為其快速、高效和簡便的優(yōu)點,可輕松實現(xiàn)基因點突變、片段敲除或敲入等精確編輯,被廣泛應(yīng)用于動物、植物和微生物。本論文旨在將CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用于C.glycerinogenes的基因編輯,并進行了技術(shù)優(yōu)化和TRP1、URA3、ADE2等基因的編輯應(yīng)用,有以下主要研究成果:(1)為構(gòu)建CRISPR-Cas9系統(tǒng),設(shè)計和組裝了可以插入Cas9、sgRNA等CRISPR組件的酵母整合表達載體pMY;通過Western Blotting分析不同密碼子優(yōu)化的Cas9基因的表達情況,確定適用于C.glycerinogenes的CgCas9序列;通過靶向反篩基因TRP1敲除試驗,比較了ScSNR52p、GDPp、GAPp三種不同的啟動子在C.glycerinogenes中轉(zhuǎn)錄sgRNA的強度,結(jié)果表明只有GAP啟動子配合HH和H...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1-1CRISPR-Cas9系統(tǒng)及其衍生技術(shù)[24]

第一章緒論將轉(zhuǎn)錄激活因子與dCas9結(jié)合引起目標基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的方式，被稱為CRISPR激活（CRISPRactivation，CRISPRa）。另有一些研究將某些調(diào)節(jié)蛋白或RNA適配子與dCas9蛋白或sgRNA融合，借助sgRNA的引導(dǎo)和dCas9....

圖1-2用于Cas9表達和sgRNA轉(zhuǎn)錄的分子部件和特性

第一章緒論輯效率至為關(guān)鍵[49]。Weninger等人使用表達Cas9和轉(zhuǎn)錄sgRNA的不同啟動子進行組合，嘗試在P.pastoris中建立CRISPR-Cas9系統(tǒng)，但是在96種組合中只有6種組合可實現(xiàn)有效的基因編輯[41]。這意味著篩選適用于特定....

圖2-1pMY質(zhì)粒構(gòu)建Fig.2-1TheconstructionoftheplasmidpMY

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文pPIC9K質(zhì)粒為模板，hrAOX1t_F和hrAOX1t_R為引物PCR擴增得到序列的插入片段AOX1t（約270bp），其5′端有20bp長度的序列與插的3′端MCS序列互補。pURGAP為模板，hrURA5_F和....

圖2-2pMY-ScCas9和pMY-CgCas9質(zhì)粒構(gòu)建Fig.2-2TheconstructionofintegrativeexpressionvectorpMY-ScCas9andpMY-CgCas9

第二章材料與方法有一個SV40NLS。pUC57-Cas9質(zhì)粒（由生工學(xué)院陳獻忠教授饋贈，熱帶假絲酵母（CandidatR質(zhì)粒，含針對假絲酵母密碼子優(yōu)化后的Cas9基因）為模板，CgCa9_R為引物，PCR擴增得到約4.2kb大小的CgCas9基因片....

本文編號：3912270