兩系雜交水稻在我國(guó)水稻生產(chǎn)中占有舉足輕重的地位,為保障我國(guó)糧食安全發(fā)揮了重大作用。培育兩系雜交水稻最關(guān)鍵的是選育性狀優(yōu)良的不育系。tms5是我國(guó)應(yīng)用最廣泛的溫敏不育基因。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)TMS5進(jìn)行定點(diǎn)編輯,獲得了一系列TMS5基因功能缺失的突變體。主要研究結(jié)果如下:(1)成功構(gòu)建pCAMBIA1301-Cas9-TMS5-gRNA表達(dá)載體,并將其通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化粳稻品種F197,獲得57株組培苗,其中有36株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。(2)對(duì)T₀代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株TMS5的突變情況分析,結(jié)果表明,在36株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株中,有23株檢測(cè)到TMS5發(fā)生突變,突變率為63.89%。TMS5的突變類型包括雜合突變和純合突變,其中雜合突變有15株,純合突變有8株,純合突變率占到了34.78%。純合突變主要是在PAM前第3和第4堿基之間有單堿基A、T和G的插入,分別占了62.5%、25%和12.5%,而單堿基C的插入沒(méi)有檢測(cè)到。(3)對(duì)T₁代純合缺失突變體的不育起點(diǎn)溫度和農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查分析,結(jié)果表明,28℃可能是tms5突變體花粉育性...

【文章頁(yè)數(shù)】：48 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 前言
    1.1 水稻光溫敏雄性不育系的研究進(jìn)展
        1.1.1 水稻光溫敏雄性不育系的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 影響水稻光溫敏雄性不育的因素
    1.2 水稻光溫敏不育基tms5 的研究進(jìn)展
        1.2.1 水稻光溫敏不育基因tms5 的定位與分子機(jī)理研究
    1.3 CRCRISPR/Ca S系統(tǒng)的研究進(jìn)展
        1.3.1 基因編輯技術(shù)的原理
        1.3.2 CRCRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)
        1.3.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
        1.3.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類
        1.3.5 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)理
        1.3.6 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在水稻中的應(yīng)用
    1.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)的技術(shù)創(chuàng)新
        1.4.1 CRISPR-Cpf1
        1.4.2 單堿基編輯
        1.4.3 DNA-free
        1.4.4 CRISPR/xCas9
    1.5 目的與意義
第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 水稻材料
        2.1.2 載體與菌株類型
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要培養(yǎng)基
        2.1.5 常用抗生素及其他試劑配制
        2.1.6 主要引物
        2.1.7 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)
        2.2.2 引物退火形成雙鏈
        2.2.3 CRISPR/Cas載體的構(gòu)建
    2.3 水稻材料的遺傳轉(zhuǎn)化
        2.3.1 種子消毒
        2.3.2 接種
        2.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷
    2.4 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的獲得
        2.4.1 水稻葉片DNA提取(CTAB法)
        2.4.2 PCR檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株
    2.5 測(cè)序檢測(cè)靶位點(diǎn)
    2.6 T₁代無(wú)選擇標(biāo)記基因突變株的獲得
    2.7 碘-碘化鉀染色檢測(cè)花粉育性
    2.8 主要農(nóng)藝性狀考查與分析
第3章 結(jié)果與分析
    3.1 靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)
    3.2 CRISPR/Ca S9 表達(dá)載體的構(gòu)建
    3.3 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定及突變位點(diǎn)測(cè)序分析
    3.4 T₁代無(wú)選擇標(biāo)記基因突變株的獲得及突變株不育起點(diǎn)溫度的鑒定
    3.5 T₁代植株農(nóng)藝性狀分析
第4章 小結(jié)與討論
    4.1 CRISPR/Cas9 在植物體中的編輯效率、突變特點(diǎn)和遺傳特性
    4.2 CRISPR/Cas9 在植物體中脫靶效應(yīng)
    4.3 tms5 突變體的不育起點(diǎn)溫度鑒定
    4.4 tms5 突變體農(nóng)藝性狀分析
    4.5 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3902253