發(fā)布時間：2024-01-27 11:32

　　目的研究miR-148a及HK2基因?qū)θ巳橄侔┘毎墙徒獯x途徑的影響和可能機制。方法熒光定量PCR(qPCR)檢測miR-148a在乳腺癌細胞系(MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB231)中的表達情況;ELISA法檢測葡萄糖的攝取量、建立標準曲線檢測乳酸的生成量,BrdU法檢測增殖情況,Western免疫印跡法檢測HK2蛋白水平的變化。通過TargetScan對miR-148a與HK2的作用位點進行預(yù)測,并通過雙熒光素酶報告實驗驗證miR-148a與HK2的靶向關(guān)系。然后采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除乳腺癌MCF-7細胞中HK2基因,觀察該細胞對葡萄糖攝取、乳酸生成以及增殖情況。結(jié)果miR-148a在MDA-MB231中表達量顯著降低(P<0.01);過表達miR-148a使MDA-MB231細胞的葡萄糖攝取量下降1.8倍(P<0.01)、乳酸生成量下降2.4倍(P<0.01),細胞增殖指標下降2.2倍(P<0.01);抑制miR-148a表達,MDA-MB231細胞葡萄糖攝取量上升1.6倍(P<0.01),乳酸生成量上升1.7倍(P<0...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
第1章 miR-148a通過靶向調(diào)節(jié)基因HK2對乳腺癌細胞糖酵解代謝的影響
    1.1 材料與方法
        1.1.1 細胞系
        1.1.2 實驗主要試劑
        1.1.3 實驗主要儀器
        1.1.4 細胞的復(fù)蘇
        1.1.5 細胞的培養(yǎng)
        1.1.6 細胞的傳代
        1.1.7 細胞的轉(zhuǎn)染
        1.1.8 細胞中總RNA的提取
        1.1.9 cDNA的制備
        1.1.10 HK2過表達載體構(gòu)建
        1.1.11 實時熒光定量PCR
        1.1.12 細胞培養(yǎng)液上清液中葡萄糖攝取量的檢測
        1.1.13 細胞培養(yǎng)液上清液中乳酸水平的檢測
        1.1.14 蛋白樣品的提取
        1.1.15 蛋白濃度的測定
        1.1.16 免疫印跡試驗（Western Blot）檢測HK2蛋白的表達水平
        1.1.17 BrdU法檢測細胞的增殖
        1.1.18 雙熒光素酶報告實驗
        1.1.19 統(tǒng)計學(xué)分析
    1.2 結(jié)果
        1.2.1 miR-148a在乳腺癌細胞系中的表達情況
        1.2.2 過表達miR-148a對MDA-MB231細胞的影響
        1.2.3 抑制miR-148a對MDA-MB231細胞的影響
        1.2.4 驗證miR-148a與HK2基因的靶向關(guān)系
        1.2.5 miR-148a可逆轉(zhuǎn)HK2過表達所致促葡萄糖攝取效應(yīng)
        1.2.6 miR-148a可逆轉(zhuǎn)HK2過表達所致促乳酸生成效應(yīng)
        1.2.7 miR-148a可逆轉(zhuǎn)HK2過表達所致促細胞增殖效應(yīng)
    1.3 討論
        1.3.1 miR-148a在乳腺癌細胞系中的表達情況
        1.3.2 miR-148a對MDA-MB231細胞糖代謝和細胞增殖的影響
        1.3.3 miR-148a與HK2基因存在靶向關(guān)系
        1.3.4 miR-148a靶向抑制HK2逆轉(zhuǎn)由HK2過表達所致促糖酵解和細胞增殖效應(yīng)
    1.4 小結(jié)
第2章 HK2基因缺陷型乳腺癌細胞MCF-7中糖酵解代謝的變化
    2.1 材料與方法
        2.1.1 細胞系
        2.1.2 實驗主要試劑
        2.1.3 實驗主要儀器
        2.1.4 細胞的復(fù)蘇及傳代
        2.1.5 HK2雙基因敲除載體的構(gòu)建
        2.1.6 HK2基因敲除載體轉(zhuǎn)染細胞
        2.1.7 HK2基因缺陷細胞篩選與測序分析
        2.1.8 HK2基因缺陷型MCF-7細胞葡萄糖攝取量檢測
        2.1.9 細胞培養(yǎng)液上清液中乳酸水平的檢測
        2.1.10 BrdU法檢測細胞的增殖
        2.1.11 統(tǒng)計學(xué)分析
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況鑒定
        2.2.2 基因敲除細胞株的鑒定
        2.2.3 HK2基因缺陷對MCF-7細胞葡萄糖攝取的影響
        2.2.4 HK2基因缺陷對MCF-7細胞乳酸生成的影響
        2.2.5 HK2基因缺陷對MCF-7細胞增殖變化
    2.3 討論
        2.3.1 HK2基因敲除載體的構(gòu)建
        2.3.2 HK2基因敲除細胞的獲得與鑒定
        2.3.3 HK2基因缺陷對MCF-7細胞糖酵解和細胞增殖能力的影響
    2.4 小結(jié)
參考文獻
結(jié)論
第3章 綜述 miRNA在腫瘤糖酵解過程中的相關(guān)研究
    3.1 糖酵解途徑的相關(guān)激酶研究
        3.1.1 己糖激酶與腫瘤的相互作用
        3.1.2 磷酸果糖激酶與腫瘤的相互作用
        3.1.3 缺氧誘導(dǎo)因子與腫瘤的相互作用
        3.1.4 丙酮酸激酶與腫瘤的相互作用
        3.1.5 乳酸脫氫酶與腫瘤的相互作用
    3.2 miRNA在腫瘤細胞糖酵解途徑的功能
        3.2.1 miRNA調(diào)控癌基因/抑癌基因參與糖代謝
        3.2.2 miRNA對葡萄糖攝取量的影響
        3.2.3 miRNA對乳酸生成量的影響
        3.2.4 miRNA對三羧酸循環(huán)的影響
    參考文獻
致謝
在學(xué)期間研究成果



本文編號：3886885