本文關(guān)鍵詞：禾谷鐮刀菌Rab7基因調(diào)控DON毒素生物合成的分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)是小麥赤霉病的主要病原菌之一,染赤霉病小麥可產(chǎn)生DON毒素(脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,Deoxynivalenol),影響農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全。禾谷鐮刀菌產(chǎn)生DON毒素的合成途徑已有大量研究,但對(duì)DON毒素合成的調(diào)控機(jī)制仍不十分明確,這是防控DON毒素污染的主要難題。因此,深入研究DON毒素的調(diào)控機(jī)制,對(duì)于有效控制DON毒素污染具有重要意義。本課題選擇FgRab7作為調(diào)控禾谷鐮刀菌產(chǎn)毒的關(guān)鍵因子,研究對(duì)DON毒素生物合成的調(diào)控機(jī)制,旨在通過(guò)基因調(diào)控作用削減DON毒素污染水平,為農(nóng)業(yè)病害控制奠定理論基礎(chǔ)。對(duì)禾谷鐮刀菌野生型PH-1和FgRab7敲除突變體進(jìn)行表型分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),缺失FgRab7型生長(zhǎng)速度減慢,產(chǎn)孢量明顯下降。Elsia法檢測(cè)野生型PH-1和FgRab7敲除突變體及FgRab7互補(bǔ)突變體不同時(shí)期DON毒素積累量發(fā)現(xiàn)敲除FgRab7菌株的DON毒素合成量顯著降低,35d的產(chǎn)毒量較野生型降低近11倍;互補(bǔ)FgRab7的菌株產(chǎn)毒特性試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)35d產(chǎn)毒量比敲除突變體增高了6.9倍,說(shuō)明FgRab7對(duì)禾谷鐮刀菌產(chǎn)生DON毒素有重要作用。為了闡明Rab7調(diào)控DON毒素生物合成的分子調(diào)控機(jī)制,利用酵母雙雜交技術(shù)研究了FgRab7對(duì)DON毒素合成相關(guān)基因的互作。構(gòu)建pGADT7-Tri3和pGBKT7-Rab7誘餌載體并共轉(zhuǎn)化至酵母AH109中,酵母轉(zhuǎn)化子在四缺培養(yǎng)基(SD/-Ade-/Leu-/Trp-/His)上能夠正常生長(zhǎng)且在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His/X-α-Gal平板上菌落顯藍(lán)色,證明了FgRab7與Tri3基因有相互作用。采用熒光定量PCR的方法研究FgRab7對(duì)Tri基因的表達(dá),對(duì)野生型菌株P(guān)H-1和FgRab7敲除突變體菌株在不同時(shí)期Tri3、Tri4、Tri5、Tri6、Tri101基因的表達(dá)量分析。結(jié)果表明,在野生型菌株和FgRab7敲除突變體菌株中,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),各個(gè)Tri基因的表達(dá)量逐步增高,35d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大;但在同一培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)FgRab7敲除突變體中的Tri基因表達(dá)量明顯低于野生型,推斷FgRab7通過(guò)調(diào)控Tri基因的表達(dá)減少了DON毒素的合成量。綜上所述,本論文證明禾谷鐮刀菌FgRab7在DON毒素合成中有重要作用,發(fā)現(xiàn)FgRab7與Tri3基因有明確的互作關(guān)系,FgRab7通過(guò)調(diào)控相關(guān)Tri基因的表達(dá)影響DON毒素的合成。
【關(guān)鍵詞】：禾谷鐮刀菌 FgRab7 Tri3 DON毒素 調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：河南工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S435.121.45
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1 前言12-25
• 1.1 研究背景12-23
• 1.1.1 小麥赤霉病12-13
• 1.1.2 DON毒素的危害及檢測(cè)方法13-14
• 1.1.3 DON合成途徑及相關(guān)Tri基因的研究14-17
• 1.1.4 Rab及調(diào)控研究概述17-18
• 1.1.5 調(diào)控DON毒素機(jī)制的研究進(jìn)展18-23
• 1.2 本論文的研究目的及意義23
• 1.3 本論文主要研究?jī)?nèi)容與創(chuàng)新點(diǎn)23-25
• 1.3.1 研究?jī)?nèi)容23-24
• 1.3.2 創(chuàng)新點(diǎn)24-25
• 2 材料與方法25-42
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-28
• 2.1.1 供試菌株25
• 2.1.2 培養(yǎng)基25-26
• 2.1.3 常用生化試劑、試劑盒及有關(guān)溶液26-27
• 2.1.4 儀器與設(shè)備27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-42
• 2.2.0 FgRab7的生物信息學(xué)分析28
• 2.2.1 禾谷鐮刀菌野生型PH-1 和FgRab7敲除突變體DON毒素的測(cè)定28-30
• 2.2.2 禾谷鐮刀菌基因組DNA提取30
• 2.2.3 DON合成過(guò)程中相關(guān)Tri基因的擴(kuò)增30-31
• 2.2.4 禾谷鐮刀菌基因組RNA提取及純化31-32
• 2.2.5 RT-PCR反轉(zhuǎn)錄32-33
• 2.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR33-34
• 2.2.7 pGBKT7- Rab7誘餌載體、pGADT7- Tri3融合載體的構(gòu)建34-37
• 2.2.8 酵母質(zhì)粒的制備與轉(zhuǎn)化37-38
• 2.2.9 酵母質(zhì)粒的提取38-39
• 2.2.10 誘餌載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109及轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證39-40
• 2.2.11 重組質(zhì)粒對(duì)酵母菌株AH109的細(xì)胞毒性檢測(cè)40-41
• 2.2.12 重組質(zhì)粒自激活檢測(cè)41
• 2.2.13 酵母雙雜交驗(yàn)證重組質(zhì)粒pGBKT7- Rab7和pGADT7- Tri3的互作關(guān)系41-42
• 3 結(jié)果與分析42-58
• 3.1 Rab7生物信息學(xué)分析42-44
• 3.1.1 Rab7保守域分析42-43
• 3.1.2 Rab7蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析43-44
• 3.2 禾谷鐮刀菌野生型PH-1 和FgRab7敲除突變體的表型分析44-45
• 3.2.1 禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)觀察44-45
• 3.2.2 禾谷鐮刀菌孢子形態(tài)觀察及產(chǎn)孢量統(tǒng)計(jì)45
• 3.3 禾谷鐮刀菌野生型PH-1 和FgRab7敲除突變體的DON毒素檢測(cè)45-48
• 3.4 禾谷鐮刀菌Rab7與Tri3的互作分析48-53
• 3.4.1 pGADT7- Tri3、pGBKT7- Rab7基因誘餌載體的構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證48-50
• 3.4.2 重組質(zhì)粒pGADT7- Tri3、pGBKT7- Rab7的細(xì)胞毒性檢測(cè)及自激活檢測(cè)50-52
• 3.4.4 pGADT7- Tri3和pGBKT7- Rab7的互作蛋白的鑒定52-53
• 3.5 DON合成途徑中Tri基因的擴(kuò)增53-55
• 3.5.1 DNA提取53-54
• 3.5.2 Tri基因擴(kuò)增54-55
• 3.6 實(shí)時(shí)定量PCR表達(dá)分析55-58
• 3.6.1 RNA提取55
• 3.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線55-56
• 3.6.3 Tri基因的表達(dá)與分析56-58
• 4 小結(jié)與討論58-61
• 4.1 禾谷鐮刀菌野生型PH-1 和FgRab7敲除突變體的表型分析及DON毒素的量58-59
• 4.2 FgRab7與Tri3的相互作用59
• 4.3 FgRab7對(duì)Tri基因表達(dá)的作用59-61
• 參考文獻(xiàn)61-68
• 致謝68-69
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷69

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