本文關(guān)鍵詞：增齡性胸腺萎縮相關(guān)基因的檢測及成年小鼠胸腺上皮細(xì)胞的分離富集，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：胸腺是機體內(nèi)重要的淋巴器官,空間上有序地指導(dǎo)淋巴前體細(xì)胞發(fā)育為成熟T細(xì)胞,為外周提供免疫應(yīng)答的“主力軍”。但是青春期后胸腺發(fā)生增齡性萎縮,功能逐漸丟失,導(dǎo)致初始T細(xì)胞輸出進行性減少,制約了外周T細(xì)胞的多樣性,使感染、自身免疫病的患病風(fēng)險增加。前期研究發(fā)現(xiàn)胸腺微環(huán)境的改變而非造血干細(xì)胞功能/數(shù)量的減少,可能是增齡性胸腺萎縮的主要誘因。其中TECs是胸腺微環(huán)境中最重要的細(xì)胞成分,但是由于其數(shù)量少,分離較困難,使得TECs相關(guān)研究進展緩慢。本研究以小鼠胸腺為研究對象,分析增齡性胸腺萎縮過程中胸腺的形態(tài)變化及TECs特異性基因的表達變化之間的關(guān)系,同時優(yōu)化成年TECs的分離富集方法,為進一步揭示胸腺免疫衰老的機制、TECs建系及再生胸腺等相關(guān)研究提供理論依據(jù)。目的:(1)探討增齡性胸腺萎縮過程中胸腺的形態(tài)變化及TECs重要分化發(fā)育基因的表達變化之間的關(guān)系,以闡明胸腺微環(huán)境對增齡性胸腺萎縮的誘導(dǎo)作用;(2)探尋一種具有準(zhǔn)確體內(nèi)代表性的高效TECs分離富集方法,以期為后續(xù)分子譜系分析、TECs體外建系提供高豐度的TECs。材料和方法:(1)小鼠胸腺增齡性萎縮實驗BABL/c小鼠按年齡分為A,B,C 3組,每組2只小鼠,實驗獨立重復(fù)3次,共18只。A組:1月齡小鼠;B組:4月齡小鼠;C組:16月齡小鼠。每組小鼠,一只用于做石蠟包埋,通過HE染色觀察各組胸腺形態(tài)學(xué)變化;一只用于提取RNA,通過realtime-PCR檢測各組胸腺TECs重要分化發(fā)育基因Fox N1、AIRE和Dll4的基因表達水平。(2)TECs分離富集實驗6~8周齡BABL/c小鼠分為9組,每組3只,實驗獨立重復(fù)3次,共81只。小鼠TECs分離實驗根據(jù)酶的種類與工作濃度隨機分成5個分離組:collagenase V 1.0g·L~（-1）組和Liberase TM 0.5、0.7、1.0及2.0 U?m L-1組。采用分離實驗得出的最適酶分離濃度(Liberase TM 1.0 U?m L-1)進行TECs的分離與富集。富集實驗分為4組:未進行富集處理的對照組和MACS、Percoll及Ficoll富集組。各實驗的細(xì)胞懸液通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞活力、TSCs比例以及TSCs中TECs重要標(biāo)志上皮細(xì)胞黏附分子(Ep CAM)的表達豐度,Percoll富集組與對照組還進行TECs的2個亞群——皮質(zhì)TECs(c TECs)和髓質(zhì)TECs(m TECs)比例的檢測。結(jié)果:(1)小鼠胸腺增齡性萎縮實驗A組胸腺皮、髓質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)比較完整,皮、髓質(zhì)交界清晰;B組胸腺結(jié)構(gòu)出現(xiàn)脂肪空泡,但皮、髓質(zhì)交界暫且可辨,PVS區(qū)暫無脂肪浸潤;C組胸腺結(jié)構(gòu)出現(xiàn)多處空泡結(jié)構(gòu)以及大面積的囊腫結(jié)構(gòu),PVS區(qū)被脂肪組織浸潤。此外,B組Fox N1、AIRE、Dll4 3個基因的相對表達量均明顯低于A組(P0.0001),但其均明顯高于C組(P0.05),即3個基因表達均增齡性減少。(2)TECs分離富集實驗Liberase TM 1.0 U?m L-1組中TSCs的產(chǎn)量明顯高于Liberase TM 0.5和0.7 U?m L-1組(P0.01),并且其細(xì)胞活力及消化時間均優(yōu)于collagenase V 1.0g·L~（-1）組(P0.01);3個富集組的細(xì)胞活力均較高,且組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與對照組比較,3個富集組TECs比例顯著增加(P0.05或P0.01);在3個富集組中,Percoll富集組富集的TECs比例高于其他2個富集組(P0.01);與對照組比較,Percoll富集組c TECs和m TECs的百分比及c TEC/m TEC的比值無明顯變化(P0.05)。結(jié)論:(1)在胸腺微環(huán)境中,Fox N1基因的增齡性丟失誘發(fā)TECs減少,進一步導(dǎo)致TECs特異性基因AIRE、Dll4表達增齡性降低,胸腺功能性組織逐漸減少,脂肪組織逐漸浸潤胸腺組織,致使老年胸腺髓質(zhì)區(qū)出現(xiàn)囊腫、PVS區(qū)脂肪化,從加工(陽性選擇)、檢驗(陰性選擇)、運輸(PVS區(qū))三重環(huán)節(jié)阻礙胸腺細(xì)胞生成作用,最終弱化衰老胸腺的功能。(2)Liberase TM較collagenase V更適用于消化成年小鼠胸腺,且其最適消化濃度為1.0 U?m L-1。本研究采用的3種富集方法均可以提高TECs比例,對細(xì)胞的破壞均較小;且Percoll富集法最有效,在富集后不影響TECs亞群細(xì)胞比例,便于后續(xù)實驗操作。
【關(guān)鍵詞】：胸腺 增齡性胸腺萎縮 胸腺上皮細(xì)胞 分離富集
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R583
【目錄】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 中英文縮略詞對照表12-15
• 第1章 緒論15-16
• 第2章 綜述16-23
• 2.1 胸腺的結(jié)構(gòu)、功能及器官發(fā)生16-18
• 2.2 胸腺的增齡性萎縮18-21
• 2.3 TECs分離方法的研究現(xiàn)狀21-23
• 第3章 材料和方法23-32
• 3.1 主要試劑和設(shè)備23-25
• 3.1.1 試劑23-24
• 3.1.2 器材與儀器24-25
• 3.2 主要試劑配制25-26
• 3.3 實驗動物26
• 3.3.1 實驗動物26
• 3.3.2 實驗動物分組26
• 3.4 實驗方法26-31
• 3.4.1 樣品采集26
• 3.4.2 石蠟切片及HE染色26-27
• 3.4.3 Realtime-PCR27-29
• 3.4.4 細(xì)胞懸液的制備29
• 3.4.5 分離實驗29
• 3.4.6 富集實驗29-30
• 3.4.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測30-31
• 3.5 統(tǒng)計學(xué)分析31-32
• 第4章 結(jié)果32-41
• 4.1 增齡性胸腺萎縮實驗32-35
• 4.1.1 各組胸腺組織的形態(tài)學(xué)變化32-33
• 4.1.2 各組胸腺組織基因表達水平的檢測33-35
• 4.2 TECs的分離實驗35-37
• 4.2.1 消化時間35
• 4.2.2 細(xì)胞活力35
• 4.2.3 TSCs的產(chǎn)量35
• 4.2.4 TECs的產(chǎn)量35-37
• 4.3 TECs的富集實驗37-41
• 4.3.1 3種TECs富集方法的細(xì)胞活力、TSCs和TECs比例37-39
• 4.3.2 Percoll富集組中c TECs與m TECs的比例39-41
• 第5章 討論41-45
• 5.1 增齡性胸腺萎縮實驗41-42
• 5.2 TECs的分離實驗42-43
• 5.3 TECs的富集實驗43-45
• 第6章 結(jié)論45-46
• 參考文獻46-52
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果52-53
• 致謝53

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本文編號：386806