疫霉菌屬于卵菌,被稱為“植物毀滅者”。其中最臭名昭著的是引起馬鈴薯晚疫病的致病疫霉菌(Phytophthora infestans),它曾導致19世紀“愛爾蘭大饑荒”,至今仍給現(xiàn)代馬鈴薯生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失。而寄生疫霉菌(P.parasitica),在系統(tǒng)發(fā)育上與致病疫霉菌關(guān)系較近,不僅引起煙草黑脛病,并且能夠侵染范圍非常廣泛的植物。它們都是半活體營養(yǎng)型病原菌,在侵染早期需要抑制植物細胞壞死維持活體營養(yǎng),后期通過誘導細胞壞死轉(zhuǎn)入死體營養(yǎng),因此對寄主植物細胞死亡的調(diào)控在侵染過程中尤為重要。RXLR效應蛋白是卵菌特有的一類分泌致病因子,能夠進入植物細胞并發(fā)揮毒性功能。致病疫霉菌和寄生疫霉菌基因組中存在上百個RXLR效應基因,只有少數(shù)基因的功能得到部分解析。RXLR效應蛋白生物學功能的研究以及其宿主靶標的鑒定有助于揭示疫霉菌致病機理,挖掘未知抗病基因以及制定有效的病害防控策略。本研究利用農(nóng)桿菌介導的瞬時表達技術(shù)對致病疫霉菌和寄生疫霉菌候選RXLR效應基因進行了初步分析,包括它們在植物中的亞細胞定位,激發(fā)細胞壞死或抑制細胞壞死的能力,以及對病原菌侵染的貢獻;進一步利用實時定量PCR、PEG-C...

【文章頁數(shù)】：133 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 卵菌概述
        1.1.1 卵菌系統(tǒng)發(fā)育
        1.1.2 卵菌病害
    1.2 植物與卵菌互作的分子機制
        1.2.1 植物免疫系統(tǒng)
        1.2.2 胞內(nèi)NLR受體的識別模式
        1.2.3 ETI和PTI下游信號
        1.2.4 卵菌的致病機理
    1.3 RXLR效應基因研究進展
        1.3.1 RXLR效應基因大量存在于疫霉菌基因組
        1.3.2 RXLR效應蛋白的分泌及轉(zhuǎn)運
        1.3.3 RXLR效應蛋白的生物學功能研究策略
        1.3.4 RXLR效應蛋白抑制植物免疫
        1.3.5 RXLR效應蛋白的寄主靶標
    1.4 本研究的目的及意義
第二章 致病疫霉菌RXLR效應蛋白初步分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 試驗材料
        2.1.2 候選RXLR效應基因的克隆及載體構(gòu)建
        2.1.3 農(nóng)桿菌介導的瞬時表達分析
        2.1.4 亞細胞定位觀察
        2.1.5 蛋白免疫印跡
        2.1.6 寄生疫霉接菌分析
        2.1.7 植物培養(yǎng)及擬南芥轉(zhuǎn)化
        2.1.8 RNA提取及半定量PCR
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 候選PiRXLR效應基因的分析及克隆
        2.2.2 候選PiRXLR效應基因在煙草中的瞬時表達分析
        2.2.3 候選PiRXLR效應蛋白在本氏煙草中的亞細胞定位分析
        2.2.4 致病疫霉菌和寄生疫霉菌Avrblb2同源基因的亞細胞定位
        2.2.5 Avrblb2同源基因激發(fā)煙草細胞壞死
        2.2.6 Avrblb2同源基因?qū)χ参锷L表型以及感病性的影響
    2.3 討論
        2.3.1 RXLR效應蛋白靶向不同亞細胞結(jié)構(gòu)抑制植物免疫
        2.3.2 Avrblb2同源蛋白特異定位于植物細胞核
        2.3.3 Avrblb2同源基因激發(fā)植物細胞壞死
        2.3.4 Avrblb2同源基因?qū)χ参锏挠绊?br>第三章 寄生疫霉菌RXLR效應基因PpE4功能分析
    3.1 材料與方法
        3.1.1 試驗材料
        3.1.2 載體構(gòu)建
        3.1.3 DNA、RNA提取及實時定量PCR
        3.1.4 農(nóng)桿菌介導的瞬時表達
        3.1.5 病毒誘導的基因沉默
        3.1.6 植物培養(yǎng)及擬南芥轉(zhuǎn)化
        3.1.7 寄生疫霉菌培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化子制備
        3.1.8 寄生疫霉菌接菌分析
        3.1.9 熒光顯微鏡觀察
        3.1.10 蛋白免疫印跡
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 PpE4在寄生疫霉菌侵染早期高度上調(diào)表達
        3.2.2 PpE4的多態(tài)性分析
        3.2.3 PpE4激發(fā)細胞壞死的分析
        3.2.4 PpE4的分泌及轉(zhuǎn)運
        3.2.5 植物中表達PpE4使植物更感病
        3.2.6 PpE4沉默減弱寄生疫霉菌的致病性
    3.3 討論
        3.3.1 PpE4在侵染早期高度上調(diào)表達
        3.3.2 PpE4從吸器分泌并轉(zhuǎn)運至植物細胞
        3.3.3 PpE4對病原菌毒性的貢獻
        3.3.4 PpE4激發(fā)的細胞死亡與植物識別相關(guān)
        3.3.5 PpE4的缺失以及變異分析
第四章 與PiAvr3a共線性的寄生疫霉菌基因PpAvh3a的功能分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試驗材料
        4.1.2 載體構(gòu)建
        4.1.3 RNA提取及實時定量PCR
        4.1.4 PpAvh3a-mCherry過表達轉(zhuǎn)化子制備及分析
        4.1.5 熒光顯微鏡觀察
        4.1.6 PpAvh3a的瞬時表達分析
        4.1.7 PpAvh3a轉(zhuǎn)基因擬南芥的分析
        4.1.8 胼胝質(zhì)沉積分析
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 PpAvh3a與致病疫霉菌Avr3a以及寄生霜霉ATR1共線性
        4.2.2 PpAvh3a與Avr3a和ATR1蛋白序列差異較大
        4.2.3 PpAvh3a在寄生疫霉菌中相對保守
        4.2.4 侵染過程中PpAvh3a在吸器特異積累
        4.2.5 PpAvh3a-mCherry過表達轉(zhuǎn)化子致病力減弱
        4.2.6 PpAvh3a在煙草中不激發(fā)細胞壞死
        4.2.7 PpAvh3a不抑制PTI或ETI
        4.2.8 在植物中表達PpAvh3a不促進病原菌侵染
    4.3 討論
第五章 結(jié)論與創(chuàng)新點
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點
參考文獻
附錄
    附錄1 培養(yǎng)基及試劑配方
    附錄2 候選RXLR效應基因引物
    附錄3 RXLR效應基因構(gòu)建情況以及亞細胞定位
    附錄4 PpE4以及PpAvh3a相關(guān)引物及載體構(gòu)建
致謝
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本文編號：3869436