低聚龍膽糖(Gentiooligsaccharide)是一類葡萄糖經(jīng)由β-1,6-糖苷鍵連接形成的新型功能性低聚糖,包括龍膽二糖、少量的龍膽三糖和四糖,它具有低熱量、低甜度的特性和清理腸道的功能,被廣泛應用于甜品、飲料行業(yè)。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,簡稱Bgl)能以葡萄糖為底物,通過逆水解反應制備低聚龍膽糖,然而,產(chǎn)物中除少量纖維二糖、昆布二糖、槐糖等副產(chǎn)物外,基本只含有龍膽二糖,無法檢測出三糖及以上聚合度的寡糖。有資料表明,β-1,6-葡聚糖酶(β-1,6-glucanase,簡稱Bgn16)能以龍膽二糖作為供、受體底物,合成龍膽三糖乃至四糖。本研究通過序列分析、表達驗證和定點突變探究了GH3家族β-葡萄糖苷酶逆水解反應機制,確定了影響酶逆水解活性的關(guān)鍵氨基酸�；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果,從數(shù)據(jù)庫中挖掘出具備高逆水解活性的Talaromyces cellulolyticusβ-葡萄糖苷酶TcBgl3A,并選取T.cellulolyticus來源的β-1,6-葡聚糖酶TcBgn16與TcBgl3A協(xié)同制備低聚龍膽糖。最后,對重組菌P.pastoris KM71/pPIC9K-t...

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 低聚龍膽糖概述
        1.1.1 低聚龍膽糖的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及應用
        1.1.2 低聚龍膽糖的制備
    1.2 β-葡萄糖苷酶概述
        1.2.1 β-葡萄糖苷酶的來源及應用
        1.2.2 β-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)和催化機制
    1.3 β-1,6-葡聚糖酶概述
        1.3.1 β-1,6-葡聚糖酶的來源
        1.3.2 β-1,6-葡聚糖酶的反應類型及應用
    1.4 畢赤酵母表達系統(tǒng)概述
    1.5 立題依據(jù)和研究意義
    1.6 論文研究主要內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 表達菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基
    2.2 分子生物學基本方法
        2.2.1 質(zhì)粒提取、產(chǎn)物純化、瓊脂糖凝膠回收
        2.2.2 E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選
        2.2.3 P.pastoris KM71 感受態(tài)細胞的制備、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選
        2.2.4 TpBgl3A的突變體構(gòu)建
    2.3 分析方法
        2.3.1 菌體濃度的測定
        2.3.2 SDS-PAGE電泳分析
        2.3.3 蛋白濃度的測定
        2.3.4 重組β-葡萄糖苷酶及β-1,6-葡聚糖酶的酶活測定
        2.3.5 重組β-1,6-葡聚糖酶的純化
        2.3.6 重組β-葡萄糖苷酶及β-1,6-葡聚糖酶的酶學性質(zhì)測定
        2.3.7 重組β-葡萄糖苷酶的動力學及轉(zhuǎn)苷/水解比參數(shù)測定
        2.3.8 重組β-1,6-葡聚糖酶的底物特異性分析
    2.4 發(fā)酵方法
        2.4.1 重組P.pastoris KM71 的搖瓶發(fā)酵
        2.4.2 重組E.coli BL21(DE3)的搖瓶發(fā)酵
        2.4.3 重組P.pastoris KM71的3.6 L罐高密度發(fā)酵
    2.5 低聚龍膽糖的制備
        2.5.1 β-葡萄糖苷酶制備龍膽二糖
        2.5.2 β-葡萄糖苷酶與β-1,6葡聚糖酶協(xié)同制備低聚龍膽糖
        2.5.3 低聚龍膽糖的檢測
    2.6 基因篩選與分子對接
        2.6.1 GH3家族β-葡萄糖苷酶的基因篩選
        2.6.2 結(jié)構(gòu)模擬與分子對接
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 +1受體位點對β-葡萄糖苷酶逆水解活性影響的機制研究
        3.1.1 β-葡萄糖苷酶的基因篩選及其在龍膽二糖制備中的性能表征
        3.1.2 +1受體位點對酶逆水解活性影響的機制研究
    3.2 高逆水解活性β-葡萄糖苷酶的基因挖掘及應用
        3.2.1 基于優(yōu)勢特征序列的高逆水解活性酶的基因挖掘及重組表達
        3.2.2 T.cellulolyticusβ-葡萄糖苷酶的酶學性質(zhì)
        3.2.3 T.cellulolyticusβ-葡萄糖苷酶制備龍膽二糖的條件優(yōu)化
    3.3 β-葡萄糖苷酶與β-1,6-葡聚糖酶協(xié)同制備低聚龍膽糖的研究
        3.3.1 T.cellulolyticusβ-1,6-葡聚糖酶的重組表達
        3.3.2 T.cellulolyticusβ-1,6-葡聚糖酶的酶學性質(zhì)
        3.3.3 TcBgl3A與 TcBgn16 協(xié)同制備低聚龍膽糖的應用研究
    3.4 重組菌的3.6L罐高密度發(fā)酵水平初步研究
        3.4.1 重組菌P.pastoris KM71/pPIC9K-tcbgl3a的3.6 L罐發(fā)酵
        3.4.2 重組菌P.pastoris KM71/pPIC9K-tcBgn16的3.6 L罐發(fā)酵
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻
附錄:作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文



本文編號：3865613